(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211289928.7 (22)申请日 2022.10.21 (71)申请人 博雅干细胞科技有限公司 地址 214092 江苏省无锡市滨湖区马山 梅 梁路88号博雅干细胞公司 (72)发明人 魏卿　肖海蓉　刘庆喜　 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 29/00(2006.01) (54)发明名称 培养脂肪间充质干细胞制备外泌体 (57)摘要 本发明涉及培养脂肪间充质干细胞制备外 泌体。 一方面， 本发明涉及使用脂肪间充质干细 胞分离提取的外泌体， 其具有50～200nm的平均 粒径， 膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％， 膜蛋白 CD81的阳性表达率大于80％； 该外泌体是使用 IL‑1β处理脂肪间充质干细胞然后在低氧分压 的环境中对细胞进行培养， 接着通过对培养液进 行差速离心制备得到的。 本发明还提供上该外泌 体的制备方法， 其医疗用途。 本发明外泌体具有 优良的生物调控性能和生物学活性。 权利要求书3页 说明书24页 附图3页 CN 115478048 A 2022.12.16 CN 115478048 A 1.使用脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体， 其具有50～200nm的平均粒径， 膜蛋白 CD9的阳性表达率大于70％， 膜蛋白CD81的阳性表达率大于8 0％； 该外泌体是使用脂肪间充 质干细胞通过包括如下步骤的方法制备 得到的： (1)将脂肪间充质干细胞接种至培养瓶中， 添加MSC完全培养基， 置37℃、 5％CO2培养箱 中培养使细胞贴壁， 再向培养液中添加IL ‑1β 至浓度8～12ng/mL， 继续培养； 脂肪间充质干 细胞是通过包括如下步骤的方法制备 得到的： (a)在生物安全柜中处 理经2‑8℃冷链运输 至实验室的脂肪样本； (b)使脂肪样本离心， 移取上层脂肪组织， 再使用D ‑Hanks液清洗一遍， 再次离心， 移取 脂肪组织， 加入1％ Ⅱ型胶原酶振荡消化； (c)消化结束后， 加一倍体积D ‑hanks液稀释， 离心， 留取底层的细胞沉淀进行接下来的 操作； (d)取步骤(c)所得细胞沉淀， 加入原代增补培养基重悬， 取样计数， 按照规定细胞量接 种至培养瓶； 置CO2培养箱中培养； 所述原代增补培养基是以DMEM ‑F12培养基为基质配制并 加入： 1％血小板裂解物、 1％人血白蛋白、 2μg/ml重组胰岛素、 15ng/ml的EGF、 25ng/ml的 bFGF、 0.12％硫代 甘油、 1％果糖； (e)培养3d后培养基全换液一次， 至细胞融合度达80％以上后， 去旧培养基， 用D ‑hanks 液清洗细胞， 加入重组胰酶溶液消化细胞， 使细胞脱落， 加入D ‑hanks液稀释， 离心， 将细胞 沉淀用原 代增补培 养基重悬， 即得原 代脂肪间充质干细胞； (f)使原代脂肪间充质干细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代， 得P1代细 胞； 以此类 推， 依次得到P2 ～P8代间充质干细胞； (2)吸弃培养基， 更换为新鲜的MSC完全培养基， 使细胞继续于37℃、 5％CO2培养箱中培 养直至细胞融合度≥80％； (3)吸弃培养基， 用PBS清洗， 然后添加 MSC完全培养基， 再置于37℃、 2％O2、 5％CO2培养 箱中培养42～56小时； (4)吸取细胞 上清液置 离心管中， 进行如下离心处 理： 以250～350g、 4℃离心8～12分钟， 吸取 上清液至另一离心管中； 以1500～2500g、 4℃离心18～ 25分钟， 吸取 上清液至另一离心管中； 以8000～12000g、 4℃离心25～35分钟， 上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管 中； 以80000～120000g、 4℃离心75～120分钟， 弃 上清； (5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬， 以80000～120000g、 4℃离心75～120 分钟， 弃上清液， 加无菌PBS使外泌体重悬， 得到呈 悬液形式的外泌体。 2.根据权利要求1的外泌体， 其中， 步骤(b)中， 两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作； 和/或， 加入2倍体积的1％ Ⅱ型胶原酶振荡消化3 0min； 步骤(c)中， 离心以10 0xg离心5mi n的条件进行操作； 步骤(d)中， 按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5 ×104/cm2接种至T75 瓶； 和/或， 步骤(d)中， CO2培养箱中培 养的条件为： 5％CO2， 37℃， 饱和湿度； 和/或， 步骤(e)中每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min； 和/或， 步骤(e)中以100xg离心权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115478048 A 210min； 和/或， 步骤(e)中每瓶加入10ml的D ‑hanks液稀释。 3.根据权利要求1的外泌体， 其中， 所述D‑Hanks液的配方组成如下： 8.0g的NaCl、 0.4g的KCl、 0.06g的KH2PO4、 0.08g的 Na2HPO4.12H2O、 0.3 5g的NaHCO3、 水至10 00ml； 和/或， 所述DMEM ‑F12培养基配方组成如下： 无水氯化钙116.6mg、 L ‑亮氨酸59.05mg、 亚油酸 0.042mg、 五水硫酸铜0.0013mg、 L ‑赖氨酸盐酸盐91.25mg、 硫辛酸0.105mg、 九水硝酸铁 0.05mg、 L ‑蛋氨酸17.24 mg、 酚红8.1mg、 七水硫 酸亚铁0.417mg、 L ‑苯丙氨酸35.48mg、 1,4 ‑丁 二胺二盐酸盐0.081mg、 氯化钾311.8mg、 L ‑丝氨酸26.25mg、 丙酮酸钠55mg、 氯化镁28.64 mg、 L‑苏氨酸53.45mg、 维生素H0.0035mg、 无水硫酸镁48.84mg、 L ‑丙氨酸4.45mg、 D ‑泛酸钙 2.24mg、 氯化钠7000mg、 L ‑天门冬酰胺7.5mg、 氯化胆碱8.98mg、 无水磷酸二氢钠54.35mg、 L ‑ 天门冬氨酸6.65mg、 叶酸2.65mg、 磷酸氢二钠71.02mg、 L ‑半胱氨酸盐酸盐17.56mg、 i ‑肌醇 12.6mg、 七水硫酸锌0.432mg、 L ‑谷氨酸7.35mg、 烟酰胺2.02mg、 L ‑精氨酸盐酸 盐147.5mg、 L ‑ 脯氨酸17.25mg、 盐酸吡哆醛2mg、 L ‑胱氨酸盐酸盐31.29mg、 L ‑色氨酸9.02mg、 盐酸吡哆醇 0.031mg、 L ‑谷氨酰胺365mg、 L ‑酪氨酸38.4mg、 核黄素0.219mg、 甘氨酸18.75mg、 L ‑缬氨酸 52.85mg、 盐酸硫胺2.17mg、 L ‑组氨酸盐酸盐31.48 mg、 D‑葡萄糖3151mg、 胸苷0.365mg、 L ‑异 亮氨酸54.47mg、 次黄嘌呤2mg、 维生素B12为0.68mg、 水适 量加至10 00mL。 4.根据权利要求1的外泌体， 其中， 步骤(1)中， 间充质干细胞 是P2～P8代的细胞， 例如是P3～P7代的细胞； 步骤(1)中， 所述培养瓶中以(0.5～5) ×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞， 例如以 (0.5～2)×10^4个细胞/ cm^2的密度添加细胞； 步骤(1)使用T75培养瓶， 每瓶接种(2～10) ×10^5个细胞例如6 ×10^5个细胞， 添加培 养基10～ 20ml； 步骤(1)中， 培 养20～30小时例如培 养24小时使细胞贴壁； 步骤(1)中， 添加I L‑1β 后继续培 养20～30小时例如培 养24小时； 步骤(3)中， 在37℃、 2％O2、 5％CO2培养箱中培 养48小时； 步骤(4)中， 首先以250g、 4℃离心12分钟， 接着以2500g、 4℃ 离心18分钟， 接着以8000g、 4℃离心3 5分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以120 000g、 4℃离心75分钟； 步骤(4)中， 首先以350g、 4℃离心8分钟， 接着以1500g、 4℃离心25分钟， 接着以12000g、 4℃离心25分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以80 000g、 4℃离心120分钟； 步骤(4)中， 首先以300g、 4℃离心10分钟， 接着以2000g、 4℃离心20分钟， 接着以 10000g、 4℃离心3 0分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以10 0000g、 4℃离心 90分钟； 步骤(5)中， 以100000g、 4℃离心90分钟， 或者以80000g、 4℃离心120分钟， 或者以 120000g、 4℃离心75分钟； 步骤(5)中， 所 得的外泌体悬 液置‑80℃保存； 和/或， 步骤(5)中， 以步骤(1)之1.2 ×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬， 例 如用0.5～ 2ml无菌PBS重悬， 例如用1ml无菌PBS重悬。 5.根据权利要求1的外泌体， 其中， 步骤(1)中， 在添加IL ‑1β 的同时还向培养液中添加 酒石酸钠、 赖氨酸， 二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、 2.0～ 2.5mg/mL， 例如二 者的浓度分别为0.15mg/mL、 2.2mg/mL。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 11547804