(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211289924.9 (22)申请日 2022.10.21 (71)申请人 博雅干细胞科技有限公司 地址 214092 江苏省无锡市滨湖区马山 梅 梁路88号博雅干细胞公司 (72)发明人 魏卿　肖海蓉　刘庆喜　 (51)Int.Cl. A61K 35/28(2015.01) A61P 29/00(2006.01) C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称 羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途 (57)摘要 本发明涉及羊膜间充质干细胞源外泌体及 其用途。 一方面， 本发明涉及从羊膜间充质干细 胞分离提取的外泌体在制备用于治疗炎性疾病 的药物中的用途， 所述外泌体具有50～200nm的 平均粒径， 外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于 70％， 膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％。 本发 明的外泌体是使用羊膜间充质干细胞经IL ‑1β 处理后在低氧分压条件下培养得到的。 还涉及使 用外泌体调控外周血单个核细胞(PBMC)分泌 TNF‑α水平的方法， 以及使用羊膜间充质干细胞 分离提取的外泌体和其制法。 本发 明外泌体具有 生物调控性能。 权利要求书4页 说明书22页 附图3页 CN 115475181 A 2022.12.16 CN 115475181 A 1.从羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途， 所述外泌体具有50～200nm的平均粒径， 例如其具有75～150nm的平均粒径； 并且所述外泌 体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD 81。 2.根据权利要求1的用途， 其中所述外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％， 例如大 于75％； 和/或， 所述外泌体膜蛋白CD 81的阳性表达率大于80％， 例如大于85％。 3.根据权利要求1的用途， 所述外泌体是使用羊膜间充质干细胞通过包括如下步骤的 方法制备 得到的： (1)将间充质干细胞接种 至培养瓶中， 添加MSC完全培养基， 置37℃、 5％CO2培养箱中培 养使细胞贴壁， 再向培养液中添加IL ‑1β 至浓度8～12ng/mL， 继续培养； 所述羊膜间充质干 细胞是通过包括如下步骤的方法制备 得到的： (a)从胎盘样品采集盒中取出胎盘， 置于白瓷盘中， 使用基础平衡盐溶液反复冲洗表 面， 对胎盘进行消毒处 理； (b)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿 中， 使用基础平衡盐溶液反复清 洗表面污血， 剪碎成直径为5mm 的羊膜组织小块； 用300目滤网过滤， 生理盐水冲洗残血， 组 织块转移至50ml离心管； (c)组织消化： 在37℃恒温摇床中， 将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm 振荡消化30～60min； 消化结束后， 加2ml胎牛血清混匀终止； 用200目滤网过滤并用大量生 理盐水清洗， 收集滤 液； (d)分别对滤 液部分和组织 块部分进行细胞培 养： 滤液部分： 收集的滤液以1500rpm离心5min， 去上清， 用生理盐水重悬清洗细 胞沉淀； 以 1500rpm离心5min， 去上清， 将细胞沉淀用完全培养基重悬； 计数仪计取有核细胞数并用台 盼兰染色测定细胞活率； 以每 瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中， 添加20ml完全 培养基， 晃匀后在5％CO2、 37℃培养箱中培养； 定期换液； 培养10～15天后传代至P1代， 继续用完全 培养基培养； 所述完全培养基包括： DMEM ‑F12培养基、 10％FBS、 100 μg/mL青霉素、 50 μg/mL链 霉素、 0.01～0.05％硝 酸硫胺、 0.05～0.1％麦芽糖， 所述DMEM ‑F12培养基是DMEM ‑F12以体 积比1： 1配制的培 养基； 组织块部分： 将收集的组织块置于75cm2培养瓶中， 使组织块能够覆盖培养瓶中一半 的 培养面积， 添加完全培养基没过组织， 晃匀后于5％CO2、 37℃培养箱中培养； 2d后补液10ml 完全培养基， 继续培养； 较多间充质干细胞爬出后去组织， 定期换液； 培养10～15天后传代 至P1代， 继续用完全培 养基培养； (e)P1代细胞收获： 用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后， 收 集细胞， 计数并测定细胞活率， 冻存， 即得P1代的羊膜间充质干细胞； (f)纯化培养和传代： 以5000～15000个/cm2的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养 瓶中用完全培养基培养， 第3 ‑4天全换液； 继续培养至第11天， 用用胰酶消化液(包含0.25％ 的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化细胞， 用完全培养基终止消化， 1400rpm离心5分 钟， 收集沉淀即为P2 代羊膜间充质干细胞； (g)P2代细 胞再以步骤(f)的方式纯化培养和传代， 得P3代细胞； 以此类推， 依次得到P3 ～P8代间充质干细胞； (2)吸弃培养基， 更换为新鲜的MSC完全培养基， 使细胞继续于37℃、 5％CO2培养箱中培权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 115475181 A 2养直至细胞融合度≥80％； (3)吸弃培养基， 用PBS清洗， 然后添加 MSC完全培养基， 再置于37℃、 2％O2、 5％CO2培养 箱中培养42～56小时； (4)吸取细胞 上清液置 离心管中， 进行如下离心处 理： 以250～350g、 4℃离心8～12分钟， 吸取 上清液至另一离心管中； 以1500～2500g、 4℃离心18～ 25分钟， 吸取 上清液至另一离心管中； 以8000～12000g、 4℃离心25～35分钟， 上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管 中； 以80000～120000g、 4℃离心75～120分钟， 弃 上清； (5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬， 以80000～120000g、 4℃离心75～120 分钟， 弃上清液， 加无菌PBS使外泌体重悬， 得到呈 悬液形式的外泌体。 4.根据权利要求1的用途， 其中： 以上制备羊膜间充质干细胞的方法中， 所述基础平衡 盐溶液是通过如下方式配制得到的： 将0 .4g的KCl、 0 .06g的KH2PO4、 0 .132g的 Na2HPO4.12H2O、 8g的NaCl、 0.35g的NaHCO3、 1.0g的D ‑葡萄糖、 0.10g的链霉素、 0.06g的青霉 素用水溶解并定容成1L的溶液； 以上制备羊膜间充质干细胞的方法中， 所述混合酶消 化液 中包含： 0.1mg/ml的I型胶原酶， 0.3mg/ml的II型胶原酶， 0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ ml的中性蛋白酶； 和/或， 以上制备羊膜间充质干细胞的方法步骤(e)中， 胰酶消化液是包括 0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。 5.根据权利要求1的用途， 其中： 步骤(1)中， 间充质干细胞 是P2～P8代的细胞， 例如是P3～P6代的细胞； 步骤(1)中， 所述培养瓶中以(0.5～5) ×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞， 例如以 (0.5～2)×10^4个细胞/ cm^2的密度添加细胞； 步骤(1)中， 使用T75培养瓶， 每瓶接种(2～10) ×10^5个细胞例如6 ×10^5个细胞， 添加 培养基10～ 20ml； 步骤(1)中， 培 养20～30小时例如培 养24小时使细胞贴壁； 和/或， 步骤(1)中， 添加I L‑1β 后继续培 养20～30小时例如培 养24小时。 6.根据权利要求1的用途， 其中： 步骤(3)中， 在37℃、 2％O2、 5％CO2培养箱中培 养48小时； 步骤(4)中， 首先以250g、 4℃离心12分钟， 接着以2500g、 4℃ 离心18分钟， 接着以8000g、 4℃离心3 5分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以120 000g、 4℃离心75分钟； 步骤(4)中， 首先以350g、 4℃离心8分钟， 接着以1500g、 4℃离心25分钟， 接着以12000g、 4℃离心25分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以80 000g、 4℃离心120分钟； 步骤(4)中， 首先以300g、 4℃离心10分钟， 接着以2000g、 4℃离心20分钟， 接着以 10000g、 4℃离心3 0分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以10 0000g、 4℃离心 90分钟； 步骤(5)中， 以100000g、 4℃离心90分钟， 或者以80000g、 4℃离心120分钟， 或者以 120000g、 4℃离心75分钟； 步骤(5)中， 所 得的外泌体悬 液置‑80℃保存； 步骤(5)中， 以步骤(1)之1.2 ×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬， 例 如用0.5～ 2ml无菌PBS重悬， 例如用1ml无菌PBS重悬； 和/或，权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 115475181 A 3