(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211289418.X (22)申请日 2022.10.20 (71)申请人 博雅干细胞科技有限公司 地址 214092 江苏省无锡市滨湖区马山 梅 梁路88号博雅干细胞公司 (72)发明人 魏卿　肖海蓉　刘庆喜　裴丽环　 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 29/00(2006.01) (54)发明名称 具有炎症调控功能的脐带间充质干细胞源 外泌体的制法 (57)摘要 本发明涉及具有炎症调控功能的脐带间充 质干细胞源外泌体的制法。 本发 明从脐带间充质 干细胞中分离提取外泌体的方法包括如下步骤： 将间充质干细胞接种至培养瓶中， 培养使细胞贴 壁， 再向培养液中添加IL ‑1β培养； 更换完全培 养基后于37℃、 2％O2、 5％CO2培养箱中培养； 使 细胞进行离心得到呈悬液形式的外泌体。 本发明 还涉及所制备的外泌体在制备用于治疗炎性疾 病的药物中的用途。 本发明方法具有外泌体收率 高等优点。 权利要求书2页 说明书14页 附图2页 CN 115537389 A 2022.12.30 CN 115537389 A 1.从脐带间充质干细胞中分离提取外泌体的方法， 该 方法包括如下步骤： (1)将间充质干细胞接种 至培养瓶中， 添加MSC完全培养基， 置37℃、 5％CO2培养箱中培 养使细胞贴壁， 再向培 养液中添加I L‑1β 至浓度8～12ng/mL， 继续培 养； (2)吸弃培养基， 更换为新鲜的MSC完全培养基， 使细胞继续于37℃、 5％CO2培养箱中培 养直至细胞融合度≥80％； (3)吸弃培养基， 用PBS清洗， 然后添加 MSC完全培养基， 再置于37℃、 2％O2、 5％CO2培养 箱中培养42～56小时； (4)吸取细胞上清液置离心管中， 进行如下离心处理： 以250～350g、 4℃离心8～12分 钟， 吸取上清液至另一离心管中； 以1500～2500g、 4℃离心18～25分钟， 吸取上清液至另一 离心管中； 以8000～12000g、 4℃离心25～35分钟， 上清液用0.22 μm滤膜过滤后置于另一离 心管中； 以80 000～120000g、 4℃离心75～120分钟， 弃 上清； (5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬， 以80000～120000g、 4℃离心75～120 分钟， 弃上清液， 加无菌PBS使外泌体重悬， 得到呈 悬液形式的外泌体。 2.根据权利要求1的方法， 步骤(1)中， 间充质干细胞 是P2～P8代的细胞， 例如是P3～P6代的细胞； 所述培养瓶中以(0.5～5) ×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞， 例如以(0.5～2) ×10^ 4个细胞/cm^2的密度添加细胞。 在一个实施方案中， 步骤(1)使用T75培养瓶， 每瓶接种2～ 10×10^5个细胞例如5 ×10^5个细胞， 添加培 养基10～ 20ml； 培养20～30小时例如培 养24小时使细胞贴壁； 或者， 添加IL‑1β 后继续培 养20～30小时例如培 养24小时。 3.根据权利要求1的方法， 步骤(3)中， 在37℃、 2％O2、 5％CO2培养箱中培 养48小时。 4.根据权利要求1的方法， 步骤(4)中， 首先以250g、 4℃离心12分钟， 接着以2500g、 4℃离心18分钟， 接着以8000g、 4℃离心35 分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以120 000g、 4℃离心75分钟； 首先以350g、 4℃离心8分钟， 接着以1500g、 4℃离心25分钟， 接着以12000g、 4℃离心25 分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以80 000g、 4℃离心120分钟； 或者， 首先以300g、 4℃ 离心10分钟， 接着以2000g、 4℃ 离心20分钟， 接着以10000g、 4℃ 离心30 分钟， 上清液用0.2 2 μm滤膜过 滤后以10 0000g、 4℃离心 90分钟。 5.根据权利要求1的方法， 步骤(5)中， 以100000g、 4℃离心90分钟， 或者以80000g、 4℃ 离心120分钟， 或者以120000g、 4℃离心75分钟； 所得的外泌体悬液置 ‑80℃保存； 或者， 以步 骤(1)之1 ×10^6个细胞 获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬， 例如用0.5～2ml无菌PBS重 悬。 6.根据权利 要求1的方法， 步骤(1)中， 在添加IL ‑1β 的同时还向培养液中添加酒石酸钾 钠、 赖氨酸， 二者的浓度分别为0.125～0.175mg/mL、 2.0～2.5mg/mL， 例如二者的浓度分别 为0.15mg/mL、 2.2mg/mL； 或者， 所得外泌体的平均 粒径为50～200nm， 例如平均粒径为75～ 150nm。 7.根据权利要求1的方法， 所 得外泌体表达 了膜蛋白CD9和膜蛋白CD 81。 8.根据权利 要求7的方法， 外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率为大于65 ％， 例如大于70％， 例如大于75％。 在一个实施方案中， 外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率为大于75％， 例如大于权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115537389 A 280％， 例如大于85％。 9.根据权利要求1的方法， 所述脐带间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得 到的： (a)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面 淤血， 剪取脐带并去除内部血 管； (b)剥取脐带中的华 通氏胶， 清洗， 剪成2 ～3mm^3的小块， 转移至T75 培养瓶中； (c)向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基， 轻轻晃动培养瓶， 使脐带组织块平铺于培养 瓶中， 于37℃、 5％CO2培养箱中静置培养， 每间隔2 ‑3天补液一次， 共补液2 ‑3次后， 去除组织 块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养直至细胞生长至融合度达70％时， 得到的细胞 接下来进行消化； (d)将培养瓶中的培养基吸弃， 吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的培养基， 添加3mL的重 组胰蛋白酶溶液消化， 轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部， 加入MS C完全培养基中和胰蛋 白酶以终止消化过程， 用移液器吹散细胞， 收集细胞悬液于离心管中， 离心、 弃上清液， 得到 细胞沉淀记为P0代次的细胞； (e)将P0代细 胞沉淀用MSC完全培养基重悬， 进行细 胞计数， 然后 接种至培养瓶中， 补充 上述MSC完全培养基， 37℃、 5％CO2培养箱中培养至细胞融合度达80％， 吸弃培养瓶中的培 养基， PBS润洗培养瓶以去除残留的培养基， 添加重组胰蛋白酶溶液消化， 轻拍培养瓶使细 胞脱落至培养瓶底部， 加入MS C完全培养基将胰蛋白酶 中和以终止消化过程， 用移液器吹散 细胞， 收集细胞 悬液于离心管中， 离心、 弃 上清液， 得到细胞沉淀记为P1代细胞； (f)重复步骤(e)进行MSC细胞的传代培 养， 直至细胞代次为P3～P 8代， 即得。 10.权利要求1～9任一项所述方法制备的外泌体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的 用途。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115537389 A 3