(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211234056.4 (22)申请日 2022.10.10 (71)申请人 同济大学 地址 200092 上海市杨 浦区四平路1239号 (72)发明人 闫香珍　雷笑霄　罗礼君　 (74)专利代理 机构 北京市诚辉律师事务所 11430 专利代理师 韩晶　范盈 (51)Int.Cl. C12N 5/077(2010.01) A61K 35/32(2015.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 43/00(2006.01) (54)发明名称 一种三维细胞球 体及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种三维细胞球体的制备方 法， 该制备方法包括： 将壳聚糖溶液置于细胞培 养板/培养瓶表面， 烘干后成为壳聚糖膜； 对所述 壳聚糖膜进行消毒之后， 将细胞接种于壳聚糖膜 上， 获得三维细胞球体。 本发明将细胞培养在壳 聚糖膜上形成三维细胞球体， 方法简单， 容易制 作且具有很好的重复性， 与传统的二维培养方法 相比， 此方法制备的三维细胞球体提升了细胞的 克隆形成能力及抗炎性能， 有利于炎症微环境下 的组织再生。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 115491348 A 2022.12.20 CN 115491348 A 1.一种三维细胞球体的制备方法， 其特征在于， 该制备方法包括： 将壳聚糖溶液置于细 胞培养板/培养瓶表面， 烘干后成为壳聚糖膜； 对所述壳聚糖膜进行消毒之后， 将细胞接种 于壳聚糖膜上， 获得三维细胞球 体。 2.根据权利要求1所述的三维细胞球体的制备方法， 其特征在于， 该制备方法具体包括 以下步骤： 将壳聚糖 溶液以大于等于0.2 5mL/cm2接种于培养板/培养瓶上， 于 大于等于50℃的温度 环境下烘干， 获得壳聚糖膜， 备用； 对所述壳聚糖膜进行消毒； 将细胞以大于等于0.25 ×104/cm2接种于包被壳聚糖涂膜的培养板上， 培养大于等于1 天后获得三维细胞球 体。 3.根据权利要求1所述的三维细胞球体的制备方法， 其特征在于， 在对所述壳聚糖膜进 行消毒的步骤中， 具体包括： 用75％乙醇将所述壳聚糖膜浸泡大于等于1小时； 和/或， 利用紫外线对所述壳聚糖膜光照大于等于 6小时。 4.根据权利要求1所述的三维细胞球体的制备方法， 其特征在于， 该制备方法还包括： 将壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中， 在高温高压的环境下使壳聚糖粉末完全溶解， 获得壳聚 糖溶液。 5.根据权利要求4所述的三维细胞球体的制备方法， 其特征在于， 所述醋酸溶液的浓度 大于等于1mo l/L， 所述壳聚糖溶 液的浓度大于等于 0.25％(M /M)。 6.根据权利要求1所述的三维细胞球体的制备方法， 其特征在于， 该制备方法还包括： 收集冠延长手术切除的牙龈、 正畸拔除牙齿的牙周膜及牙髓、 种植过程颌骨骨髓腔来源骨 屑， 原代培养人牙 龈成纤维细胞、 牙周膜细胞、 骨髓 基质细胞、 牙髓细胞， 获得用于接种于所 述壳聚糖膜上的细胞。 7.一种三维细胞球体， 其特征在于， 根据权利要求1至6中任一项所述的三维细胞球体 的制备方法所制得的三维细胞球 体。 8.如权利要求7 所述的三维细胞球 体在抗炎、 组织再生以及免疫调节领域的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115491348 A 2一种三维细胞球体及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物医学工程技术领域， 具体涉及一种三维细胞球体及其制备方法和 应用。 背景技术 [0002]牙周炎是导致我国成年人牙齿丧失的主要原因， 炎症微环境是组织再生的关键瓶 颈。 种子细胞在组织工程中具有主要作用， 基于细胞的组织再生策略需要 大量种子细胞， 传 统的二维培养环境异于细胞体内生长环境， 培养的细胞生物性能等方面异于体内细胞， 难 以发挥治疗潜能。 [0003]三维细胞球体能够保证细胞与细胞之间以及细胞与基质之间更好的相互作用， 在 植入体内时能够保存完整的细胞外基质， 有助于细胞功能的表达与发挥。 目前三维细胞培 养方法包括细胞悬浮培养瓶， 悬滴法及 超低粘附培养皿等， 但这些方法具有成球效率低， 操 作不方便等 缺点。 发明内容 [0004]为解决上述 技术问题， 本发明提供一种三维细胞球 体及其制备 方法和应用。 [0005]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0006]本发明提供一种三维细胞球体的制 备方法， 该制 备方法包括： 将壳聚糖溶液置于 细胞培养板/培养瓶表面， 烘干后成为壳聚糖膜； 对所述壳聚糖膜进行消毒之后， 将细胞接 种于壳聚糖膜上， 获得三维细胞球 体。 [0007]进一步的， 该制备方法具体包括以下步骤： 将壳聚糖溶液以大于等于0.25mL/cm2 接种于培养板/培养瓶上， 于大于等于50℃的温度环境下烘干， 获得壳聚糖膜， 备用； 对 所述 壳聚糖膜进行消毒； 将细胞以大于等于0.25 ×104/cm2接种于包被 壳聚糖涂膜的培养板上， 培养大于等于1 天后获得三维细胞球 体。 [0008]进一步的， 在对所述壳聚糖膜进行消毒的步骤中， 具体包括： 用75％乙醇将所述壳 聚糖膜浸泡大于等于1小时； 和/或， 利用紫外线对所述壳聚糖膜光照大于等于 6小时。 [0009]进一步的， 该制备方法还包括： 将壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中， 在高温高压的环 境下使壳聚糖粉末完全溶解， 获得壳聚糖溶 液。 [0010]进一步的， 所述醋酸溶液的浓度大于等于1mol/L， 所述壳聚糖溶液的浓度大于等 于0.25％(M /M)。 [0011]进一步的， 该制备方法还包括： 收集冠延长手术切除的牙龈、 正畸拔除牙齿的牙周 膜及牙髓、 种植过程颌骨骨髓腔来源骨屑， 原代培养人牙龈成纤维细胞、 牙周膜细胞、 骨髓 基质细胞、 牙髓细胞， 获得用于 接种于所述壳聚糖膜上的细胞。 [0012]本发明还提供一种三维细胞球体， 根据上述的三维细胞球体的制备方法所制得的 三维细胞球 体。 [0013]本发明也提供如上述的三维细胞球体在抗炎、 组织再生以及免疫调节领域的应说　明　书 1/3 页 3 CN 115491348 A 3