ICS 11.220 CCS B 41 福 35 建 省 地 方 标 准 DB35/T 2026—2021 口蹄疫病毒（O 型）抗体高敏荧光免疫分析 操作规程 Detection of foot and mouth disease virus (O type) antibody by hypersensitive fluorimetric immunoassay 2021 - 11 - 23 发布 2022 - 02 - 23 实施 福建省市场监督管理局 发 布 DB35/T 2026—2021 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 仪器与试剂 ......................................................................... 1 6 口蹄疫病毒（O 型）抗体高敏荧光检测卡的制备 .......................................... 2 7 检测 ............................................................................... 3 8 判定标准 ........................................................................... 4 附录 A（规范性） 试剂的配制 ........................................................... 5 附录 B（资料性） 口蹄疫病毒（O 型）抗体高敏荧光检测卡装配示意图 ....................... 6 I DB35/T 2026—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福州海关提出并归口。 本文件起草单位：福州海关技术中心、成都微瑞生物科技有限公司、厦门市翰均科检测科技有限公 司、上海德雨航生物科技有限公司、一品一码检测（福建）有限公司。 本文件主要起草人：郑腾、张体银、吴冠英、吴俊清、章键、谢向机、张志灯、唐寰宇、林杰、 王武军、庄锴、李宋钰、邱金生。 II DB35/T 2026—2021 口蹄疫病毒（O 型）抗体高敏荧光免疫分析操作规程 1 范围 本文件规定了镧系高敏荧光免疫分析牛、羊、猪血清中的口蹄疫病毒（O型）抗体的操作规程。 本文件适用于牛、羊、猪血清中口蹄疫病毒（O型）抗体水平的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PVC：聚氯乙烯（polyvinylchloride） 5 仪器与试剂 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.2 5.2.1 5.2.2 仪器 高敏荧光分析仪。 移液器移液器（0.5 μL～10 μL 和 10 μL～100 μL）。 恒温培养箱（20 ℃～25 ℃和 37 ℃±1 ℃）。 离心机（3 000 r/min 和 18 000 r/min）。 切条机。 划膜喷金机。 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 一级水的要求。 高敏荧光纳米微球。 1 DB35/T 2026—2021 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.2.9 5.2.10 5.2.11 5.2.12 6 N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。 口蹄疫病毒（O 型）重组抗原。 1%聚乙烯醇。 牛血清白蛋白（BSA）。 鸡卵黄抗体（IgY） 兔抗鸡卵黄抗体/免疫球蛋白 G 抗体（IgY/IgG 抗体）。 碳二亚胺（EDC）。 硝酸纤维素膜。 2-N-吗啡啉乙磺酸（MES）。 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 口蹄疫病毒（O 型）抗体高敏荧光检测卡的制备 6.1 检测线和质控线的包被 把硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，采用划膜喷金机在硝酸纤维素膜上喷涂已经稀释成0.5 mg/mL 的兔抗鸡IgY/IgG抗体形成质控线（C线），喷涂已经稀释成1.0 mg/mL的口蹄疫病毒（O型）重组抗原形 成检测线（T线），喷量为均1 μL/cm，然后在37 ℃±1 ℃的温度下烘制8 h。 6.2 硝酸纤维素膜的处理 用封闭液（配制方法应符合附录A中的A.1）封闭硝酸纤维素膜30 min，用10 mmol/L磷酸盐缓冲液 （配制方法应符合附录A中的A.2）清洗硝酸纤维素膜30 min，室温（20 ℃～25℃）干燥2 h后备用。 6.3 高敏荧光纳米微球标记鸡 IgY 将50 mg的高敏荧光纳米微球加入到5 mL的2-N-吗啡啉乙磺酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）中，再 加入10 mg碳二亚胺和10 mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温（20 ℃～25 ℃）反应 30 min后，在4 ℃下，18 000 r/min离心10 min，取离心后沉淀物用50 mL硼酸缓冲液（pH 8.2，配制 方法应符合附录A中的A.3）重悬，加入2 mg透析过的鸡IgY，在室温（20 ℃～25℃）下搅拌反应24 h， 在4 ℃下，18 000 r/min离心10 min，取离心沉淀物加入5 mL含0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液进 行封闭，再加入5 mL样品稀释液（配制方法应符合附录A中的A.4）保存（2 ℃～8 ℃）。 6.4 高敏荧光纳米微球标记口蹄疫病毒（O 型）重组抗原 将50 mg的高敏荧光纳米微球加入到5 mL的2-N-吗啡啉乙磺酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）中，再 加入10 mg碳二亚胺和10 mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温（20 ℃～25 ℃）反应 30 min后在4 ℃下，18 000 r/min离心10 min，取离心沉淀物用50 mL的0.05 mol/L硼酸缓冲液（pH8.2， 配制方法应符合附录A中的A.3）重悬，加入2 mg透析过的口蹄疫病毒（O型）重组抗原，在室温（20 ℃～ 25 ℃）下搅拌反应24 h，在4 ℃下，18 000 r/min离心10 min，取离心沉淀物加入5 mL含0.5%牛血清 白蛋白的磷酸盐缓冲溶液封闭，再加入5 mL样品稀释液（配制方法应符合附录A中的A.4）保存（2 ℃～ 8 ℃）。 2 DB35/T 2026—2021 6.5 标记物垫的包被和处理 将高敏荧光纳米微球标记的鸡IgY抗体和口蹄疫病毒O型重组抗原，分别稀释成0.1 μg/mL 和3 μg/mL，采用点膜喷金机器喷涂在标记物垫上，喷量为2.5 μL/cm，然后在37 ℃±1 ℃的温度 下烘8 h。 6.6 试纸条组装 PVC底板上从左到右依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫的右端搭在标记 垫的左端上，标记垫的右端搭在硝酸纤维素膜的左端上，吸水垫的左端搭在硝酸纤维素膜的右端上。将 组装好的PVC板切成5 mm宽试纸条（装配图见附录B）。 6.7 试剂卡组装 将切割好的5 mm宽试纸条放于检测卡的下盖内，平摊后将检测卡的上盖扣紧，即可完成口蹄疫病毒 （O型）抗体高敏荧光检测试剂卡（简称试剂卡）的装配。 7 检测 7.1 样品采集与处理 7.1.1 样品的采集 应按照GB/T 18088或NY/T 541中的规定采集动物血液3 mL～5 mL。 7.1.2 样品的处理 静置后的血液样品在3 000 r/min下离心3 min，分离出的血清量应不少于500 μL。 7.1.3 样品的保存 待检血清在2 ℃～8 ℃下可保存48 h，在-20 ℃条件下可以长期保存。 7.2 准备 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.3 所有操作均应满足 GB 19489 中的相关要求。 待检血清和口蹄疫病毒（O 型）抗体高敏荧光检测试剂卡试验前应平衡至室温（20 ℃～25 ℃）。 建立工作目录，选择检测项目标准曲线。写明检测项目和检测批号信息等信息。 相应的稀释管和检测试剂卡按待检血清顺序编号标识并有序排列。 样品稀释 用样品稀释液将待检血清按1:50稀释。 7.4 加样 将平衡至室温的口蹄疫病毒（O型）抗体高敏荧光检测试剂卡置于洁净平坦的台面上，在加样孔内 滴加80 μL已1:50稀释的待检血清，避光静置15 min。 3 DB35/T 2026—2021 7.5 上机检测 加样15 min后，将待测的口蹄疫病毒（O型）抗体高敏荧光检测试剂卡插入高敏荧光分析仪检测， 即时显示并保存检测结果。应在5 min内完成检测。 7.6 结果计算 7.6.1 以 B 代表高敏荧光分析仪检测口蹄疫病毒（O 型）抗体标准品（或质控品）溶液的 T/C 荧光比 值。 7.6.2 以 B0 表高敏荧光分析仪检测稀释液的 T/C 荧光比值。 7.6.3 以一组口蹄疫病毒（O 型）抗体标准品的 B 与 B0 相减（B–B0