ICS 65.020.20 CCS B05 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2484—2021 胡萝卜小孢子培养技术规程 Technical code of practice for microspore culture of carrot 2021-12-25 发布 2022-01-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2484—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC 25）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：王葆生、陈源闽、刘晓蕊、廉勇、刘湘萍、张艳萍、朱春侠。 I DB15/T 2484—2021 胡萝卜小孢子培养技术规程 1 范围 本文件规定了胡萝卜小孢子培养技术的操作流程。 本文件适用于胡萝卜的小孢子培养。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2306 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 小孢子 microspore 高等植物生活史中雄配子体发育过程中短暂而重要的阶段，是减数分裂后四分体释放出的单倍性 单细胞。 小孢子培养 microspore culture 采用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的小孢子，通过无菌操作技术接种在人工培养基上，诱 导形成愈伤组织或胚状体，进而形成完整植株的一种培养方式。 单倍体 haploid 体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体。 4 试剂 超纯水 应符合GB/T 6682中规定的三级超纯水。 1 DB15/T 2484—2021 药品 消毒试剂：乙醇，氯化汞。 无机试剂：硝酸铵，硝酸钾，硫酸铵，氯化钙、硝酸钙，硫酸镁，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，碘 化钾，硼酸，硫酸锰，硫酸锌，钼酸钠，硫酸铜，氯化钴，硫酸亚铁，EDTA 二钠盐。 有机试剂：肌醇，烟酸，盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸，叶酸，生物素，谷氨酰胺，丝氨 酸，谷胱甘肽。 生长调节剂：2,4-D，6-BA。 其他试剂：琼脂，活性炭，蔗糖。 所有药品等级均为分析纯。 5 仪器设备 纯水仪，万分之一分析天平，pH计，移液枪，恒温培养箱，电磁炉，超净工作台，高压灭菌锅，离 心机，光学显微镜。 6 培养基配制灭菌与分装 小孢子培养各阶段使用商品化的B5、NLN、MS和1/2MS基本培养基，具体成分及含量见附录A。按培 养基说明书用量加入基本培养基、根据附录A的用量加入除琼脂外的其它成分，待培养基内所有组分充 分溶解后，调pH值至5.8，定容，按附录A的用量加入琼脂粉，分别制成分离培养基、诱导培养基、分化 培养基和生根培养基。 将配制好的培养基分装至三角瓶中封口后进行高压蒸汽灭菌，灭菌应符合NY/T 2306的规定。灭菌 结束后，待培养基温度降至55 ℃～60 ℃时，在超净工作台中将分离培养基、诱导培养基、分化培养基 分装至培养皿中、生根培养基分装至三角瓶中，自然冷却。 7 小孢子培养技术流程 采样 选择生长势好、无病虫害的健壮植株，于晴天上午取开花后15 d～25 d的花序。剥取花药压片并使 用1%醋酸洋红染色，镜检筛选花粉母细胞处于单核期的花序。 外植体消毒 将花序用自来水冲洗10 min，用剪刀将小花依次剪下，置于烧杯中，在超净工作台中依次用75 %乙 醇50 s、0.1 %氯化汞4 min消毒、无菌水冲洗6次，沥干水分。 小孢子分离 将消毒后的小花转入无菌研钵，加入1倍体积的分离培养基，用研棒轻研，液体经400目筛过滤至10 mL离心管中，700 r/min离心3 min，去上清液，沉淀用1 mL分离培养基悬浮。重复上述步骤2次后，将 5 -1 悬浮液加入液体诱导培养基中，将小孢子浓度调至1×10 个·mL 。吸取2 ml移入固体诱导培养基中。 诱导胚状体 2 DB15/T 2484—2021 将培养皿放入恒温培养箱中33 ℃下暗培养2 d，然后25 ℃下暗培养50 d～120 d至胚状体产生。 胚状体分化 当小孢子分化出胚状体时，将胚状体接种于分化培养基中。将培养皿放入培养箱中，培养条件为光 -1 照强度1500 lx，16 h·d ，温度26 ℃。培养30 d左右可以形成小苗。 诱导生根 选取生长健壮的离体再生苗移植到生根培养基上，每个三角瓶中放置2～3株。将培养瓶放至培养箱 -1 中，培养条件为光照强度1500 lx，16 h·d ，温度26 ℃，培养2至4周直至小苗生出完整根系。 炼苗与移栽 将培养瓶放置于日光温室中，打开瓶盖，加水至培养基上1 cm，炼苗3 d，然后将根部培养基清洗 干净，栽种于装有消毒育苗基质的营养钵中，浇水后用塑料袋覆盖保湿，7 d后取掉塑料袋。温度白天 控制在25 ℃±3 ℃，夜晚12 ℃±3 ℃。 8 倍性鉴定 取幼苗根尖，采用根尖压片法进行压片，在显微镜下观察染色体数目，当再生植株染色体数目为9 条时，证明该植株为单倍体。 3 DB15/T 2484—2021 A A 附 录 A （资料性） 培养基成分及用量 A.1 商品基本培养基成分用量见表 A.1。 表A.1 商品基本培养基成分及用量表 单位为毫克每升 分离培养基 诱导培养基 分化培养基 生根培养基 B5 NLN MS 1/2MS 2500 125 1900 950 0 0 1650 825 (NH4)2SO4 134 0 0 0 CaCl2·2H2O 150 0 440 220 0 500 0 0 MgSO4 122.09 61.04 180 90 KH2PO4 0 125 170 85 NaH2PO4 130.44 0 0 0 MnSO4·H2O 10 18.94 22.3 22.3 H3BO3 3 10 6.2 6.2 ZnSO4·7H2O 2 10 8.6 8.6 Na2MoO4·2H2O 0.25 0.25 0.25 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 0.025 0.025 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 0.025 0.025 0.025 KI 0.75 0 0.83 0.83 FeSO4·7H2O 27.8 27.8 27.8 27.8 Na2EDTA·2H2O 37.3 37.3 37.3 37.3 肌醇 100 100 100 100 盐酸硫胺素 10 0.5 0.1 0.1 盐酸吡哆醇 1 0.5 0.5 0.5 烟酸 1 5 0.5 0.5 甘氨酸 0 2 2 2 叶酸 0 0.5 0 0 生物素 0 0.05 0 0 L-谷氨酰胺 0 800 0 0 L-丝氨酸 0 100 0 0 谷胱甘肽 0 30 0 0 培养基成分 KNO3 NH4NO3 Ca(NO3)2·4H2O 4 DB15/T 2484—2021 A.2 培养基其他添加物成分及用量见表 A.2。 表A.2 培养基其它添加物成分及用量表 单位为克每升 分离培养基 诱导培养基 分化培养基 生根培养基 B5 NLN MS 1/2MS 2,4-D 0 0.0005 0 0 6-BA 0 0 0.0005 0 活性炭 0 0.02 0 0 蔗糖 30 130 30 30 琼脂 0 7 7 7 添加物成分 5