ICS 65.020.20 B 05 江 DB36 西 省 地 方 标 准 DB36/T 1426—2021 作物青枯病菌 LAMP 检测技术规程 Technique rules for LAMP detection of ralstonia solanacearum on tuber crops 2021 - 06 - 30 发布 江西省市场监督管理局 2022 - 01 - 01 实施 发 布 DB36/T 1426—2021 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 样品 .............................................................................. 1 5 LAMP 扩增.......................................................................... 2 6 结果判断 .......................................................................... 2 附录 A（资料性） LAMP 检测引物、5×LAMP 混合引物配制及扩增体系和条件 ................... 3 I DB36/T 1426—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职业学院、瑞昌市农业农村局。 本文件主要起草人：李信申、曾荣、华菊玲、黄小梅、沈爱喜、陈建、黄建华、洪芸。 II DB36/T 1426—2021 作物青枯病菌 LAMP 检测技术规程 1 范围 本文件规定了作物（主要指芝麻、马铃薯、甘薯、花生、番茄、茄子、辣椒等）青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的LAMP检测技术。 本文件适用于作物（主要指芝麻、马铃薯、甘薯、花生、番茄、茄子、辣椒等）青枯病菌的定性检 测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2601 植物病原细菌常规检测规范 SN/T 3296 植物病原细菌分子生物学检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 LAMP 扩增技术 Loop-mediated isothermal amplification 环介导等温扩增技术（简称LAMP扩增技术）是一种可于特定恒温条件下，实现短时间内对靶标序列 高效扩增的技术。检测结果通过肉眼观察绿色荧光的生成进行判断。该技术具有“简便、快速、精确、 低价”的特点。已广泛用于病害的诊断及病原菌的定性定量检测。 4 样品 4.1 采集 将新鲜的疑似病株用吸水纸包好，整株带回实验室，保存于4℃冰箱备用。 4.2 处理 截取适量待检测样品，剪碎后悬浮于装有适量无菌水的试管中，静置30 min后，取悬浮液；或加适 量无菌水研磨，静置5 min，取上清液。以悬浮液或上清液为模板，以无菌水为空白对照，进行LAMP 检测。 5 LAMP 扩增 1 DB36/T 1426—2021 5.1 扩增模板 以提取的疑似作物病株样品组织悬浮液或上清液为模板，以模式菌株GMI1000菌悬液为阳性模板， 以无菌水为阴性模板，采用特异性引物（附件A）对待测样品进行LAMP检测。 5.2 扩增体系 扩增反应在25 μL体系中进行，各组分如下：2.5 μL 10×Thermo Pol buffer[20 mM Tris-HCl (PH8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100]，3.5 μL 10 mM dNTP，1.5 μL 100 mM MgSO4，5 µL 5×LAMP引物混合物（附件A），1 µL样本悬浮液或上清液，1 μL Bst DNA聚合酶2.0（8000 U/mL）, 4 μL 5 M 甜菜碱, 1 µL 12.5 mM MnCl2， 1 µL 0.6 μM钙黄绿素，去离子水补足至25 µL。 5.3 扩增条件 扩增条件为: 60℃扩增60 min，80℃ 5 min使酶热变性失活终止反应。 6 结果判断 6.1 肉眼观察 LAMP反应结束后，通过观察反应液颜色的变化进行判断。颜色变绿色为阳性结果，无颜色变化（仍 为桔红色）为阴性结果。 6.2 电泳检测 条件允许，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。取3 µL反应产物，加入0.5 µL 6倍上样缓冲液（6×loading buffer）, 混匀，在2%的琼脂糖凝胶上90 V恒压电泳30 min, 凝胶成像仪扫描拍照进行判断。出现梯形 条带为阳性结果，没有出现条带为阴性结果。 2 DB36/T 1426—2021 附 录 A （资料性） LAMP 检测引物、5×LAMP 混合引物配制及扩增体系和条件 A.1 LAMP检测引物 表A.1 LAMP检测引物 引物名称 引物序列 长度/bp F3 5’- CAACACCGGCGATGACTG -3’ 18 B3 5’- GATCGGTCGCATAGAACGC -3’ 19 FIP 5’- GGATCACGTGGTCCTGCGCCGCCATCAAGTCCGGCAAGA -3’ 40 BIP 5’- ACGCTCGGCAGCGAGATGTGCGCATCGTCAGGTTG -3’ 36 A.2 5×LAMP引物混合液 表A.2 1mL 5×LAMP混合引物配制 引物名称 母液浓度 加入量 混合液中终浓度 FIP引物 100 µM 80 µL 8 µM BIP引物 100 µM 80 µL 8 µM F3引物 100 µM 10 µL 1 µM B3引物 100 µM 10 µL 1 µM ddH2O — 820 µL — total — 1 mL — _________________________________ 3