(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210729543.1 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 徐州医科 大学 地址 221000 江苏省徐州市铜山路209号 (72)发明人 李燕强　梅洋　刘清华　郭羽白　 李丹花　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 强萌 (51)Int.Cl. C12N 9/22(2006.01) C12N 9/64(2006.01) C07K 14/36(2006.01) C07K 14/00(2006.01) C12N 15/867(2006.01)C12N 15/864(2006.01) C12N 15/861(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系 统及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种多层次严格调控自杀蛋 白rCas8活性系统及其应用， 该系统包括重组自 杀蛋白rCas8、 促进重组自杀蛋白rCas8激活的 “自杀辅助元件 ”、 保护细胞的 “保护元件 ”以及 RNA转录后的 “调控元件 ”； 其中， 所述 “自杀辅助 元件”包括链霉亲和素； 所述 “保护元件 ”包括烟 草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、 Strep ‑TagⅡ、 缺 失Strep‑TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素； 所述RNA转录后的 “调控元件 ”包括转运蛋白Rev、 在mRNA转运过程中降解mRNA的Rev ‑RNase。 本发 明基于通过多层次调控细胞死亡相关蛋白， 使其 能精准杀死靶 标细胞， 而对正常细胞具有保护作 用。 权利要求书1页 说明书6页 序列表9页 附图2页 CN 115074344 A 2022.09.20 CN 115074344 A 1.一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统， 其特征在于， 包括重组自杀蛋白 rCas8、 促进重组自杀蛋白rCas8激活的 “自杀辅助元件 ”、 保护细胞的 “保护元件 ”以及RNA转 录后的“调控元件”； 其中， 所述 “自杀辅助元件 ”包括链霉亲和素； 所述 “保护元件 ”包括烟草 蚀纹病毒的半胱氨酸蛋 白酶、 Strep ‑TagⅡ、 缺失Strep ‑TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和 素； 所述RNA转录后的 “调控元件 ”包括转运蛋白Rev、 在mRNA转运过程中降解mRNA的Rev ‑ RNase； 所述重组自杀蛋白rCas8包括Strep ‑TagⅡ、 烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶切位点以 及Caspase8凋亡关键结构域， 具有如SEQ  ID NO.1所示的序列； 所述链霉亲和素 具有如SEQ  ID NO.2所示的序列； 所述Strep‑TagⅡ具有如SEQ  ID NO.3所示的序列； 所述烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶具有如SEQ  ID NO.4所示的序列； 所述缺失Strep‑TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素 具有如SEQ  ID NO.5所示的序列； 所述转运蛋白Rev具有如SEQ  ID NO.7所示的序列； 所述Rev‑RNase包括转运蛋白Rev、 柔性连接肽以及RNA酶结构域， 具有如SEQ  ID NO.8 所示的序列。 2.根据权利要求1所述的一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统， 其特征在于， 所述“调控元件 ”还包括mRNA调控元件， 所述mRNA调控元件为促进HIV1的RNA从细胞核向细 胞质转运的RRE序列， 具有如SEQ  ID NO.6所示的序列。 3.根据权利要求1所述的一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统， 其特征在于， 所述降解mRNA的Rev ‑RNase中RNA酶结构域， 包括但不限于 MCPIP1的RNA酶结构域。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统在制备预 防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。 5.用权利要求1 ‑3任一项所述的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系 统在宿主细胞 中调控基因表达的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1)根据目标序列A， 构建腺相关病 毒载体并包装成腺相关病毒， 静脉注射进宿主体 内以保护非靶向细胞； 所述目标序列 A中表达的是所述保护 细胞的“保护元件 ”， 包括烟草蚀 纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、 St rep‑TagⅡ、 缺失Strep‑TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素； 步骤2)靶向细胞通过慢病毒过表达转运蛋白Rev， 并把这些细胞通过皮下移殖至步骤 1)所述宿主； 步骤3)根据目标序列B， 构建腺病毒载体， 并包装成腺病毒， 静脉注射步骤2)所述宿主 体内杀死靶向细胞； 所述目标序列B所含有的成分有： 由AFP启动子表达的rCas8和Survivin 启动子表达的链霉亲和素， 同时在其下游还 含有RRE序列。 6.一种试剂盒， 包括权利要求1 ‑3任一项所述的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系 统的病毒表达载体。 7.根据权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述病 毒表达载体包括但不限于腺病 毒 载体、 腺相关病毒载体、 慢病毒载体。 8.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述多层次严格调控自杀蛋白rCas8活 性系统中涉及的蛋白表达可以构建到同一个病毒载体上， 也可以把不同的表达产 物构建到 不同的病毒载体上。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074344 A 2一种多层次严格调控自杀蛋白rCa s8活性系统及其应用 技术领域 [0001]本发明属于细胞和基因工程技术领域， 具体涉及一种多层次严格调控自杀蛋白 rCas8活性系统及其应用。 背景技术 [0002]靶向杀死目标细胞同时保护非目标细胞， 是人们一直以来追求的方向。 嵌合抗原 受体T细胞免疫疗法(CAR ‑T疗法)， 是一种治疗肿 瘤的新型精准靶向疗法， 近几年通过优化 改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果， 是一种非常有 前景的， 能够精准、 快速、 高效， 且有 可能治愈癌症的新型肿瘤免疫 治疗方法。 [0003]CAR‑T疗法无疑为癌症治疗带来新希望， 然而， 这种疗法也有严重不良反应， 主要 是细胞因子释放综合征(也叫细胞因子释放风暴， CRS)和神经毒性。 如果处理不及时可能会 危及生命。 另外， CAR ‑T疗法具有自相残杀的风险： CAR ‑T细胞也是一种T细胞， 导致免疫细胞 和肿瘤细胞拥有相同的靶点。 因此， CAR ‑T不仅会杀灭的肿 瘤细胞， 亦会 “误杀”同样表达靶 点的CAR‑T伙伴， 最终导致CAR ‑T细胞被快速清除。 但以T细胞为靶细胞的CAR ‑T疗法， 大量清 除T细胞后可能使患者出现严重的免疫缺陷， 因此有科学家担心可能使患者出现类似艾滋 病的问题， 即由于免疫缺陷导致的感染。 而且高昂的治疗费用， 会使绝大部分患者承受不 起。 [0004]对目标细胞导入 “自杀基因 ”， 细胞其表达产物具有特别的敏感性， 最终导致这些 细胞的死亡。 如果精确调控这些基因只在靶标细胞表达及形成一个有功能的 “自杀蛋白 体”， 而对非靶标细胞 无杀伤性是基因疗法的重要挑战。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明提供一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统 及其应用， 基于通过多层次调控细胞死亡相关蛋白， 使其能精准杀死靶标细胞， 而对正常细 胞具有保护作用。 [0006]本发明是通过以下技 术方案实现的： [0007]一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统， 包括重组自杀蛋白rCas8、 促进重 组自杀蛋白rCas8激活的 “自杀辅助元件 ”、 保护细胞的 “保护元件 ”以及RNA转录后的 “调控 元件”； 其中， 所述 “自杀辅助元件 ”包括链霉亲和素； 所述 “保护元件”包括烟草蚀纹病毒的 半胱氨酸蛋 白酶、 Strep ‑TagⅡ、 缺失Strep ‑TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素； 所述RNA 转录后的“调控元件 ”包括转运蛋白Rev、 在mRNA转 运过程中降解mRNA的Rev ‑RNase； [0008]所述重组自杀蛋白rCas8包括Str ep‑TagⅡ、 烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶切位 点以及Caspase8凋亡关键结构域， 具有如SEQ  ID NO.1所示的序列； [0009]所述链霉亲和素 具有如SEQ  ID NO.2所示的序列； [0010]所述Strep‑TagⅡ具有如SEQ  ID NO.3所示的序列； [0011]所述烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶具有如SEQ  ID NO.4所示的序列；说　明　书 1/6 页 3 CN 115074344 A 3