(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210725149.0 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 江苏康可得生物技 术股份有限公司 地址 212000 江苏省镇江市京口区学府路 中建大观天下21-10 6室 (72)发明人 陈华标　李涛　 (74)专利代理 机构 镇江京科专利商标代理有限 公司 32107 专利代理师 夏哲华 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) A01K 67/027(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 15/55(2006.01)A61K 45/00(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用 (57)摘要 本发明涉及基因治疗 药物制备技术， 具体是 关于Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用。 本发 明的Helz2基因敲除小鼠模型的构建方法， 是通 过CRISPR/Cas9技术在小鼠受精卵上进行Helz2 基因敲除， 再通过显微注射和配繁， 获得H elz2全 身性基因敲除的纯合小鼠模型。 本发明构建了 Helz2全身性基因敲除的纯合小鼠模型和发明了 靶向Helz2基因治疗肿瘤的新疗法。 本发明可为 阐明Helz2在肿瘤发生发展中的作用机制提供可 靠的动物模型， 也为临床上针对Helz2基因在治 疗和/或预防肿瘤的药物筛选和制备中提供靶 点， 并且提供了治 疗肿瘤的新疗法。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图5页 CN 115369118 A 2022.11.22 CN 115369118 A 1.一种Helz2基因敲除小鼠模型的构建方法， 其特征是： 通过CRISPR/Cas9技术在小鼠 受精卵上进行Helz2基因敲除， 再通过显微注 射和配繁获得Helz2全身性基因敲除的小鼠模 型。 2.根据权利要求1所述的Helz2基因敲除小鼠模型的构建方法， 其特征是： 用于敲除小 鼠Helz2基因的sgRNA序列包括下述SEQ  ID No.1‑SEQ ID No.4基因序列中的一种或多种， SEQ ID No.1： 5‑GCCCCAGAGTTACCAGATGGAGG‑3’； SEQ ID No.2： 5’ ‑CCTACACCCGACAGAG GTGTAGG‑3’； SEQ ID No.3： 5’ ‑AGCAGTGACAGTCT TATGGGTGG‑3’； SEQ ID No.4： 5’ ‑GGCATACAGAG GATTGCCACAGG‑3’。 3.一种权利要求1所述Helz2全身性基因敲除的纯合小鼠模型在在制备或筛选抗肿瘤 和/或预防肿瘤药物中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征是： 所述应用包括药物靶标的筛选、 药物的筛选、 药物的药效学评价和药物的安全性评价。 5.一种用于构建Helz2基因敲除动物模型的sgRNA序列， 其特征是： 包括下述SEQ  ID  No.1‑SEQ ID No.4基因序列中的一种或多种， SEQ ID No.1： 5’ ‑GCCCCAGAGTTACCAGATGGAGG‑3’； SEQ ID No.2： 5’ ‑CCTACACCCGACAGAG GTGTAGG‑3’； SEQ ID No.3： 5’ ‑AGCAGTGACAGTCT TATGGGTGG‑3’； SEQ ID No.4： 5’ ‑GGCATACAGAG GATTGCCACAGG‑3’。 6.一种含有靶向Helz2基因的载体， 其特征是： 其靶向干扰Helz2基因的靶点序列为下 述基因序列中的一种或多种， SEQ ID No.5： 5’ ‑GCTATCAAGTCTGTCACTACT ‑3’； SEQ ID No.6： 5’ ‑GCACGATGCTGTATG GCTTTG‑3’； SEQ ID No.7： 5’ ‑GGGCCTCATTGACACTCA AAG‑3’。 7.根据权利要求6所述的含有靶向Helz2基因的载体， 其特征是： 所述载体为慢病毒载 体复合物、 腺病毒、 腺相关病毒、 N ‑乙酰半乳糖胺、 脂质体、 聚合物、 溶瘤病毒之一， 或其他生 物学上可接受的基因载体。 8.一种权利 要求6所述的含有靶向Helz2基因的载体在制备抑制Helz2基因表达的生物 制剂中的应用。 9.一种治疗和/或预防肿瘤药物， 其特征在于： 其含有靶向干扰Helz2基因或其表达的 产物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115369118 A 2Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因治疗药物制备技术， 具体是关于Helz2基因在肿瘤防治药物中的 应用。 背景技术 [0002]Helz2(Helicase  with zinc finger 2)[OMIM 611265]， 又称PRIC285或PDIP1， 是 一种2649个氨基酸的核解酶蛋白， 也是过氧化物酶体增殖物激活受体α相互作用复合体 (Peroxisome  proliferator  activated  receptorα inter acting complex， PRIC)的一部 分。 Helz2由两个ATP结合序列、 一个RNaseB结构域和双DNA/RNA解旋酶序列组成， 其参与了 多种与基因调控相关的机制， 包括基因转录、 mRNA加工和DNA修复。 它可作为PPARα和PPARγ 以及其他核受体(RXRA、 THRA、 THRB)的核转录共激活 因子。 [0003]Helz2还参与细胞脂质、 糖类代谢和肝脏代谢过程， 与脂肪细胞分化和原发性胆汁 性肝硬化密切相关。 Helz2在人和小鼠非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic  fatty liver  disease， NAFLD)中的表达上调， 其缺失激活了肝脏长型功能性瘦素受体(Functional   leptin receptor long form， Lep rb)的表达， 并抑制了 肥胖小鼠的NAFLD发展和体重增加。 据报道， Helz2的结合体PPARγ可以调节小鼠炎症 基因如Ccl3、 Ccl7、 Cxcl10和Tgtp的表达。 PPARγ在先天免疫反应中也 发挥了重要作用并与免疫相关疾病有关， 例如HCV/HIV感染、 骨 关节炎、 痤疮 。 就其本身而言， Helz2能结合对免疫反应具有重要作用蛋白的能力， 例如BCL6 和ISG15。 另外， Helz2被发现在哺乳动物中具有抗病毒功能， 该基因被鉴定为是具有抗病毒 免疫保守成分的干扰素刺激基因(Interferon  stimulated  gene， ISG)。 此外， 还发现了 Helz2在IFN抗病毒反应中的介导作用， 具体涉及Helz2转录和细胞核蛋白的上调， 以及转录 程序的激活。 [0004]然而， 利用Helz2基因敲除小鼠模型在抗肿瘤方面的研究及 应用未见报道。 为了进 一步阐明Helz2表达水平下降对肿 瘤发生发展的影响， 需要构建Helz2基因敲除小鼠， 并对 其进行肿瘤建模， 为探究Helz2影响肿瘤细胞生长机制， 抑制肿瘤发生 发展的作用以及 治疗 和/或预防肿瘤的新方法提供动物模型。 [0005]CRISPR/Cas9基因组编辑系统是细菌适应性免疫系统的一部分， 用于抵御来自噬 菌体和质粒的侵入性核酸。 CRISPR/Cas9基因编辑工具不仅功能强大， 而且具有特异性强、 效率高等特点， 可以准确、 快速地进 行基因编辑。 虽然有研究报道在细胞水平利用这一技术 干扰Helz2基因表达的研究。 但是未有利用CRISPR/Cas9系统获得纯合子Helz2基因敲除小 鼠模型与相应的研究应用。 也未有靶向Helz2基因或其表达的产物在肿瘤治疗当中的研究 及应用。 [0006]基因靶向治疗正在成为一种重要的肿瘤治疗方法。 RNA干扰(RNA  interference， RNAi)是在转录后水平抑制特定基因表达的最强大的靶向疗法之一。 人工合成RNAi主要有 两种类型： siRNA和shRNA。 之前研究已经证明了siRNA具有以下局限性： 细胞对其摄取能力 不足、 稳定性差、 在体内外易于被降解和在临床实验中递送效率低。 然而， 病毒载体介导的说　明　书 1/6 页 3 CN 115369118 A 3