(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210708212.X (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 中国人民解 放军海军军医大学第一 附属医院 地址 200433 上海市杨 浦区长海路168号 (72)发明人 郭猛　董宇超　李付琦　刘艳芳　 孙沁莹　张允硕　陈铃　 (74)专利代理 机构 上海申浩 律师事务所 31280 专利代理师 李阳 (51)Int.Cl. C07H 21/04(2006.01) C07H 1/00(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61K 47/24(2006.01)A61K 47/28(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 一种特异性激活细胞泛凋亡途径的囊泡药 物构建及应用 (57)摘要 本发明涉及生物医药领域， 具体是一种用于 特异性激活细胞泛凋亡途径的囊泡类药物及其 制备方法和应用， 其中的细胞凋亡诱导剂为体外 制备的Z构型DNA， 通过脂质体或外泌体包裹后， 可以通过细胞内吞将Z ‑DNA运输至细胞内， 从而 诱导细胞 发生泛凋亡。 本发明可以作为泛凋亡研 究的标准 化药物， 或用于肿瘤治 疗。 权利要求书2页 说明书6页 序列表5页 附图4页 CN 115304656 A 2022.11.08 CN 115304656 A 1.一种稳定的Z ‑DNA制备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： a)合成50 ‑200bp的poly(dG ‑dC)； 将poly(dG ‑dC)溶解于pH＝7.5 ‑8.0的0.5mM  EDTA· 3.5M NaCl溶液， 后将pH调制6.5； b)制备饱和溴水； c)饱和溴水以1～2倍体积逐滴加入poly(dG ‑dC)溶液， 混合后室温下轻柔颠倒混匀30 分钟， 使DNA发生溴化反应； d)在反应液中加入10％体积的四氯化碳， 振荡混匀萃取反应液中剩余的溴单质， 吸取 上层水相， 即获得含有Z ‑DNA的溶液； e)Z‑DNA溶液通过超滤浓 缩， Z‑DNA含量使用dot ‑blot进行鉴定 。 2.一种采用如权利要求1所述的制备 方法制备 得到的稳定的Z ‑DNA。 3.一种用于特异性激活细胞泛凋亡的脂质体的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (A)配制脂质材料的乙醇溶液(有机相)： 称取磷脂酰胆碱10mg～30mg、 胆固醇1mg～ 10mg， DOTAP  5mg～50mg， 溶于10mL无 水乙醇； (B)含有Z ‑DNA的水相： 如上所述的超滤浓缩后的Z ‑DNA溶液使用0.5M  PBS稀释至1～ 5ng/ μL； (C)将装有有机相的1ml注射器置于微流控泵1通道固定， 将装有水相的1mL注射器置于 微流控泵2通道固定； 按照水相:有机相的流速比2 ～5:1微流控参数进行设置； (D)启动微流控系 统， 使得有机相和水相在芯片中混合， 弃掉初始10％流出液， 收集其 余流出液， 使用NTA法表征脂质体。 4.一种采用如权利要求3的制备方法制备得到的用于特异性激活细胞泛凋亡的脂质 体。 5.一种用于诱导细胞发生泛凋亡途径的靶向外泌体的制备方法， 其特征在在于， 包括 以下步骤： 步骤一： 将人工嵌合蛋白的编码基因克隆至pcDNA3.1质粒， 转染293T细 胞， 使用无血清 培养基培养48小时， 收集培 养上清， 26 000g离心2小时收集外泌体； 步骤二： Z ‑DNA加载外泌体： 将外泌体与如上所述的Z ‑DNA溶液按照质量比10:1进行混 合， 使用超声法进行装载， 设置超声参数为60Hz超声30s， 暂停30s， 循环3次； 在超声结束后 放置在37℃的摇床， 50rpm孵育1小时， 帮助外泌体恢复膜结构； 26000g离心2小时收集外泌 体； 获得加载有人工Z ‑DNA的靶向外泌体。 6.根据权利要求5所述的用于诱导细胞发生泛凋亡途径的靶向外泌体的制备方法， 其 特征在在于， 所述的人工嵌合蛋白的编码基因序列如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.9任一所 示。 7.一种采用如权利要求5或6所述的制备方法制备得到的用于诱导细胞发生泛凋亡途 径的靶向外泌体。 8.如权利 要求2所述的Z ‑DNA、 如权利要求4所述的脂质体或如权利要求7所述的靶向外 泌体在制备诱 导细胞发生泛凋亡途径的药物中的应用。 9.如权利 要求2所述的Z ‑DNA、 如权利要求4所述的脂质体或如权利要求7所述的靶向外 泌体在构建细胞泛凋亡模型中的应用。 10.如权利要求2所述的Z ‑DNA、 如权利要求4所述的脂质体或如权利要求7所述的靶向权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115304656 A 2外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115304656 A 3