(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210713530.5 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 龙杰　刘学武　谢正军　李兴飞　 吕成　金征宇　田耀旗　柏玉香　 周星　陈龙　邱超　焦爱权　 赵建伟　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 林娟 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C12N 11/10(2006.01) C12N 9/38(2006.01) C12P 19/12(2006.01) C12P 19/04(2006.01)C12P 19/00(2006.01) C12P 19/14(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) A23L 29/00(2016.01) A23L 33/21(2016.01) A61K 8/60(2006.01) A61K 8/73(2006.01) A61K 31/7016(2006.01) A61K 31/702(2006.01) A61K 31/729(2006.01) A61P 17/00(2006.01) A61P 17/18(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) A61Q 19/02(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) (54)发明名称 一种高效固定β-琼胶酶的方法及其应用于 琼胶低聚糖的制备 (57)摘要 本发明公开了一种高效固定β ‑琼胶酶的方 法及其应用于琼胶低聚糖的制备， 属于酶工程领 域。 本发明提供的方法为将β ‑琼胶酶与一步法 制备的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合孵 育得到固定化β ‑琼胶酶。 本发明提供的高效固 定化β‑琼胶酶不仅能提高β ‑琼胶酶的催化活 性及热稳定性， 而且容易从酶解体系中分离出 来， 实现了β ‑琼胶酶的重复利用， 降低了生产成 本。 将所述固定化β ‑琼胶酶应用于琼胶低聚糖 的制备中， 大大降低了酶制剂 的原料成本， 具有 较高的工业 化应用价 值。 权利要求书1页 说明书10页 附图4页 CN 114921454 A 2022.08.19 CN 114921454 A 1.一种高效固定β ‑琼胶酶的方法， 其特征在于， 所述方法为将生物素化的β ‑琼胶酶与 链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合孵 育。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 利用链长经过修饰的生物素对β ‑琼胶酶进 行生物素化。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述链长经过修饰的生物素包括NHS ‑生物 素、 LC‑NHS‑生物素、 LCLC ‑NHS‑生物素、 PEG4 ‑NHS‑生物素或PEG24 ‑NHS‑生物素。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述生物素化的β ‑琼胶酶与链霉亲和素修 饰的磁性纳米颗粒以(1： 2)～(1： 10)质量比进行混合。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 孵 育5～25h。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 制备所述链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒 的步骤包括(a)和(b)： (a)制备磁性纳米颗粒： 将FeCl3·6H2O溶解于乙二醇中， 然后加入醋酸钠和壳聚糖， 混 合物猛烈搅拌后密封在高压釜中， 在20 0℃保温， 洗涤三次后进行干燥， 得磁性纳米颗粒； (b)链霉亲和素修饰： 取三聚氯氰溶解于二恶烷中， 接着加入40～60mg磁性纳米颗粒， 搅拌， 洗涤数次后加入链霉亲和素 溶液， 混合搅拌得到链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在 于， 步骤(a)中， 所述FeCl3·6H2O与醋酸钠的添 加比例为(1： 2)～(1： 10)， F eCl3·6H2O与壳聚糖的添加比例为(10： 2)～(20： 1)。 8.一种固定化β ‑琼胶酶， 其特征在于， 由权利要求1～7任一项所述高效固定β ‑琼胶酶 的方法制备 得到。 9.一种制备琼胶低聚糖的方法， 其特征在于， 利用权利要求8所述的固定化β ‑琼胶酶水 解琼胶。 10.权利要求1～7任一项所述高效固定β ‑琼胶酶的方法， 或权利要求8所述固定化β ‑琼 胶酶， 或权利要求9所述制备琼胶低聚糖的方法在医药、 食品和日用品领域的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921454 A 2一种高效固定β‑琼胶酶的方 法及其应用于琼胶低聚糖的制备 技术领域 [0001]本发明涉及一种高效固定β ‑琼胶酶的方法及其应用于琼胶低聚糖的制备， 属于酶 工程领域。 背景技术 [0002]琼胶具有一定粘性， 是一种公认的安全的食品添加剂， 由3,6 ‑内醚‑α‑L‑半乳糖和 β‑D‑半乳糖的琼胶二糖(G ‑AHG)重复单元 组成， 是一种中性线性多糖。 琼胶低聚糖为琼胶水 解后产生的以β ‑D‑半乳糖为还原 性末端的聚合度为2 ‑10的低聚糖。 研究表明琼胶低聚糖具 有普通寡糖无法比拟的生理功能， 如免疫调节、 抗炎活性、 抗氧化活性、 美白保湿和抑制黑 色素瘤细胞增殖等有益功能， 可以广泛应用于医药业、 食品和化妆品行业， 是一种非常有价 值的海洋功能性低聚糖。 [0003]琼胶低聚糖的制备方法主要有酸水解和酶降解两种。 其中， 酸水解方法简便， 降解 速率快， 但是会产生大量污染物， 并且产品复杂不可控， 后续分离成本较高。 相比而言， 生物 酶法通过β ‑琼胶酶直接水解琼胶的β ‑1,4糖苷键获得新琼寡糖， 具有制备环 境温和， 对环 境 友好， 产物可控度高等优势。 因此， 近年 来酶降解成为制备琼胶低聚糖的主 要方法。 [0004]但是天然的琼胶酶存在产量低， 稳定性差， 不易分离等问题， 且酶价格较昂贵， 这 些已成为制约琼胶低聚糖高效制备的主要瓶颈， 通过酶的固定化技术则可有效解决这些问 题。 固定化酶指借助载体材料将酶固定于一定空间内进行反应， 能有效抵抗环境改变对酶 活性的影响， 同时易于酶的回收使用， 简化后续分离纯化步骤， 实现酶的重复利用。 因此， 开 发一种高效实用的固定化β ‑琼胶酶能大 大降低生产成本 。 [0005]现在技术中主要采用戊二醛共价交联作用实现琼胶酶固定化， 中国专利CN   104651430A公开了一种利用戊二醛作为交联剂将琼胶酶与磁性纳米粒子共价结合的方法， 琼胶酶成功实现固定化， 具备反 复使用特点， 但是戊二醛对于琼胶酶活性影响较大， 固定化 后酶活保留率不高于40％， 且重复使用7次后相 对酶活降低为40％。 因此， 急需寻找一种可 以高效制备酶活性稳定的且可多次重复利用的固定化β ‑琼胶酶的方法。 发明内容 [0006]为提高目前存在的技术问题， 本申请人提供了一种高效固定β ‑琼胶酶的方法。 本 发明首次采用链霉亲和素和生物素的特异结合固定β ‑琼胶酶， 可以有效提高酶的稳定性， 并且实现多次重复使用。 [0007]本发明对固定化载体 的制备过程进行优化， 采用溶剂热法制 备磁性纳米粒子， 实 现一步制备得到氨基化磁性纳米颗粒。 [0008]本发明通过基于生物素/链霉亲和素的特异性识别， 将链霉亲和素修饰的磁性纳 米颗粒作为载体固定化β ‑琼胶酶， 得到了热稳定性增强的可重复使用的固定化β ‑琼胶酶， 并且其酶活得到 了一定的增强， 相对酶活最高可达13 5.67％。 [0009]本发明的技 术方案如下：说　明　书 1/10 页 3 CN 114921454 A 3