(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210708361.6 (22)申请日 2022.06.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114774469 A (43)申请公布日 2022.07.22 (73)专利权人 南京艾尔普再生医学 科技有限公 司 地址 211100 江苏省南京市江宁区龙眠大 道568号生命科技小镇1号楼 (72)发明人 葛文雪　陈涛涛　王嘉显　 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/90(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 15/12(2006.01)C12N 5/10(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/04(2006.01) 审查员 邵文博 (54)发明名称 一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、 NK 细胞及其组合物 (57)摘要 本发明涉及细胞技术领域， 具体涉及一种 ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、 NK细胞及其 组合物。 通过至少一种质粒载体将编码后的CD16 基因序列导入iPSC并最终分化为NK细胞， 所获得 的NK细胞具有增强的细胞表型及ADC C效果。 权利要求书1页 说明书11页 序列表10页 附图11页 CN 114774469 B 2022.11.08 CN 114774469 B 1.一种ADC C功能增强的NK细胞的制作方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： Ⅰ、 通过电转将表达 CD16的质粒导入到iP SC中， 得到 CD16高表达的iP SC细胞株； Ⅱ、 将步骤Ⅰ中得到的CD16高表达的iP SC细胞株分化 为NK细胞； 其中， 能够表达 CD16的质粒 是基于转 座子插入系统的Pig gyBac质粒； CD16的基因序列突变位 点为F158V和位 点S197P， 突变后的碱基序列分别是gt t和cca； 表达CD16的基于转 座子插入系统的Pig gybac质粒需要与PBase  质粒共转染； PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子， 编码CD16的序列后为 PuroR抗性筛选标记，  Ef1a启动子序列为SEQ  ID NO:2， 抗性筛选标记的序列为SEQ  ID NO: 3； 表达CD16的基于转 座子插入系统Pig gyBac质粒的序列为SEQ  ID NO:4； 所述CD16高表达的iP SC细胞株通过抗 生素筛选和一次的克隆挑选获得。 2.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法， 其特征在于， 表达的 CD16 为具有抗体Fc  段高亲和力且不可切割的突变 体。 3.如权利 要求1所述的一种 ADCC功能增强的NK细 胞的制作方法， 其特征在于， CD16的基 因序列为SEQ  ID NO:1。 4.如权利 要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法， 其特征在于， 通过所述 方法最终 获得NK细胞， 其 NK细胞的CD16表达不低于80%。 5.如权利 要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法， 其特征在于， 通过所述 方法获取一种组合物， 所述组合物中包 含ADCC增强型的NK细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774469 B 2一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方 法、 NK细胞及其组合物 技术领域 [0001]本发明属于细胞技术领域， 具体涉及到一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、 NK细胞及其组合物。 背景技术 [0002]NK细胞是一种具有肿瘤细胞杀伤能力的天然免疫细胞类型， 在肿瘤免疫细胞治疗 领域有着重要的应用。 按照来源分类， 目前肿瘤免疫细胞治疗领域使用的NK细胞绝大多数 是通过在捐献者或者患者身上提取外周血细胞 （PBMC） ， 然后通过体外分离、 改造、 扩增， 获 得最后的NK  细胞产品。 但是在工业界， 药企和生物制药公司必须要考虑到产品的生产成本 和原材料来源。 外周血来源于患者或者捐献者， 而NK细胞在外周血中的占比只有5 ‑10%， 这 很大程度上限制了稳定的供应来源。 并且通过PBMC获取的NK细胞其标志物表达及杀伤效果 都不是很理想。 因此我们引进iPSC细胞， iPSC可以在体外无限增殖并分化为功能性NK细胞， 因此iPSC技术为获得大批量质量稳定的免疫细胞提供了有潜力的解决方案 。 [0003]在实际应用方面， iPSC细胞的获得方法相对简单和稳定， 不需要使用卵细胞或者 胚胎， 这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势。 iPSC来源的NK细胞的建立进一步拉近 了干细胞和临床疾病治疗的距离 。 [0004]但是存在一个现实问题， 即未经基因修饰的iPSC细胞分化为NK细胞， 它们在其细 胞表面的CD16表达偏低， 无法通过抗体依赖性细胞毒性效应即ADC C 机制裂解靶细胞。 发明内容 [0005]本申请提供一种CD16高表达、 ADCC功 能增强的NK细胞 的制作方法、 NK细胞及其组 合物， 本方案的优点在于： 基于两种质粒系统均可实现将编码后的CD16基因导入到iPSC细 胞基因组中。 并成功分化为NK细胞， 获得CD16 ‑NK细胞系， 实现CD16表达稳定， ADCC功能增 强， NK细胞 纯度高等优点。 具体详细说明如下： [0006]为实现上述技术目的， 本申请采取的技术方案为： 一种ADCC功能增强的NK细胞的 制作方法， 包括如下步骤： [0007]步骤一： 通过电转将表达CD16的质粒导入到iPSC中， 得到CD16高表达的iPSC细胞 株； [0008]步骤二： 将上述 步骤中得到的CD16高表达的iP SC细胞株分化 为NK细胞； [0009]其中， 步骤一中能够表达 CD16的质粒至少有一种。 [0010]进一步改进在 于， 表达CD16的质粒可以是基于转座子插入系统的P iggybac质粒或 是基于同源重组的模板质粒。 [0011]进一步改进在于， 表达的CD16  为具有抗体Fc  段高亲和力且不可切割的突变 体。 [0012]进一步改进在于， CD16基因序列的突变位 点为F158V和位 点S197P。 [0013]进一步改进在于， CD16基因序列为SEQ  ID NO:1。 [0014]进一步改进在于， 表达CD16的基于转座子插入系统的Piggybac质粒需要与PBase  说　明　书 1/11 页 3 CN 114774469 B 3