(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210703870.X (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 苏州工业园区唯可达生物科技有限 公司 地址 215000 江苏省苏州市工业园区星湖 街218号生物纳米园A 2楼230-230A室 (72)发明人 郜明泉　徐建青　 (74)专利代理 机构 苏州国诚专利代理有限公司 32293 专利代理师 王会 (51)Int.Cl. A61K 39/00(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 47/65(2017.01) A61P 35/00(2006.01)C07K 19/00(2006.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名称 基于NY-ESO-1肿瘤抗原的疫苗及制备方法 (57)摘要 本发明公开基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗 及制备方法， 该疫苗通过断裂内含肽反式剪接将 抗原与抗体结合得到。 本发明中， 肿瘤抗原为NY ‑ ESO‑1， 具有较强的免疫原性， 能够广泛应用于肿 瘤疫苗等中， 克服了利用化学偶联方法等实现抗 原与抗体连接时需要加入化学试剂、 有一定毒 性、 偶联键易断裂、 化学偶联不稳定等技术问题， 本发明利用断裂内含肽GP41 ‑1反式剪接方法的 连接是通过肽键连接， 其稳定性更高， 特异性结 合更强， 反应条件温和， 效率高， 工艺简单， 且未 加入有毒有害物质， 也不会产生副产物等， 安全 性高， 为新型肿瘤疫苗的研发提供技术支撑和新 思路。 权利要求书2页 说明书6页 序列表（电子公布） 附图3页 CN 114887047 A 2022.08.12 CN 114887047 A 1.基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗， 其特征在于， 所述疫苗通过断裂内含肽反式剪接将 抗原与抗体结合得到 。 2.根据权利 要求1所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗， 其特征在于， 所述疫苗为抗体 偶联蛋白1G1 1‑NY‑ESO‑1， 重链氨基酸序列如SEQ  ID NO:10所示。 3.根据权利要求1或2所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗， 其特征在于， 所述疫苗的 抗原为NY‑ESO‑1， 所述疫苗的抗体为P D‑L1抗体1G1 1。 4.根据权利 要求1所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗， 其特征在于， 所述断裂内含肽 为GP41‑1。 5.根据权利要求1 ‑4任一所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： 步骤1)、 将抗体1G1 1与GP41‑1‑InteinN融合表达制备融合蛋白1G1 1‑IntN； 步骤2)、 将抗原NY ‑ESO‑1与GB1‑GP41‑1‑InteinC融合表达制备融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ ESO‑1； 步骤3)将融合蛋白1G11 ‑IntN与融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1混合， 通过断裂内含肽反 式剪接反应， 生成抗体偶联蛋白1G11 ‑NY‑ESO‑1， 蛋白重链氨基酸序列如SEQ  ID NO:10所 示， 轻链氨基酸序列如SEQ  ID NO:6所示， 轻链不 参与反应； 步骤1)与步骤2)无 先后顺序。 6.根据权利 要求5所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗的制备方法， 其特征在于， 步骤 1)中， 制备融合蛋白1G1 1‑IntN的步骤 包括： 步骤11)、 融合蛋白1G1 1‑IntN重链表达载体构建 以pUC57‑Kan‑GP41IN为模板， 设计碱基序列如SEQ  ID NO:3所示的Fc ‑IntN‑F引物和碱 基序列如SEQ  ID NO:4所示的Fc ‑IntN‑R引物， 通过PCR扩增Fc ‑IntN基因片段， 然后凝胶回 收相应片段， 克隆至phIgG1 ‑1G11载体上的多克隆位点BamH  I与Hind  Ⅲ之间， 构建成可表 达融合蛋白1G1 1‑IntN的重链 表达载体phIgG1 ‑1G11‑IntN； 步骤12)、 融合蛋白1G1 1‑IntN制备 将步骤11)中构建的融合蛋白1G11 ‑IntN重链表达载体与1G11轻链表达载体phIgK ‑ 1G11以一定的质量比共同转染293T细胞， 表达1G11 ‑IntN蛋白， 蛋白重链氨基酸序列如SEQ   ID NO:5所示， 轻链 氨基酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 7.根据权利 要求6所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗的制备方法， 其特征在于， 步骤 11)中， PCR扩增 程序为： 98℃10min， 98℃40s， 56℃30s， 72℃1min， 72℃10min， 10℃10min， PCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳 。 8.根据权利 要求5所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗的制备方法， 其特征在于， 步骤 2)中， 制备融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1的步骤包括： 步骤21)、 融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1表达载体构建 通过使用BamH  I和NdeI双酶切质粒pUC57 ‑Kan‑GB1‑GP41IC和pET ‑30a(+)‑NY‑ESO‑1， 分别得到GB1 ‑IntC片段和线性化载体pET ‑30a(+)‑NY‑ESO‑1， 然后使用T4连接酶构建成融 合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1表达载体pET ‑30a(+)‑GB1‑IntC‑NY‑ESO‑1； 步骤22)、 融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1制备 将步骤21)中构建的融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1表达载体pET ‑30a(+)‑GB1‑IntC‑NY‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114887047 A 2ESO‑1转化至BL21(DE3)感受态细胞， 根据pET系统手册制备融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1， 蛋白氨基酸序列如SEQ  ID NO:9所示； 使用HisTrapTM HP纯化目的蛋白。 9.根据权利 要求5所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗的制备方法， 其特征在于， 步骤 3)中， 将融合蛋白1G11 ‑IntN和融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1以不同摩尔比混合， 加入DTT， 诱导催化断裂内含肽GP41 ‑1反式剪接 反应， 剪接反应后， IntN剩余TRSGY五个氨基酸残基与 IntC的五个氨基酸残基S SSDV以肽键连接， 制备 得到所需肿瘤疫苗1G1 1‑NY‑ESO‑1蛋白。 10.根据权利要求9所述的基于NY ‑ESO‑1肿瘤抗原的疫苗的制备方法， 其特征在于， 所 述融合蛋白1G1 1‑IntN和融合蛋白GB1 ‑IntC‑NY‑ESO‑1的摩尔比为1:0.3 ‑3。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114887047 A 3