(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210703038.X (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 苏州工业园区唯可达生物科技有限 公司 地址 215000 江苏省苏州市工业园区星湖 街218号生物纳米园A 2楼230-230A室 (72)发明人 郜明泉　徐建青　 (74)专利代理 机构 苏州国诚专利代理有限公司 32293 专利代理师 黎兴科 (51)Int.Cl. A61K 39/00(2006.01) A61K 39/385(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12N 15/85(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种肿瘤疫苗及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种肿瘤 疫苗及其制备方法， 该肿瘤疫苗通过断裂内含肽的反式剪接将肿瘤 抗原与抗体结合得到。 本发明中， 肿瘤抗原为 LNM， 免疫原性强， 覆 盖范围广； 将LNM通过断裂内 含肽GP41 ‑1反式剪接， 与抗体1G11结合， 形成抗 体偶联蛋白1G11 ‑LNM， 能作为一种新型的肿瘤疫 苗； 克服现有技术中利用化学偶联方法等实现抗 原抗体连接时需要加入化学试剂、 有一定毒性、 化学偶联不稳定、 偶联键易断裂等问题， 利用断 裂内含肽GP41 ‑1反式剪接方法的连接是通过肽 键连接， 其稳定性更高， 特异性结合更 强， 反应条 件温和， 效率高， 工艺简单， 且未加入有毒有害物 质， 也不会产生副产物等， 为新型肿瘤疫苗的研 发提供技 术支撑和新思路。 权利要求书2页 说明书7页 序列表（电子公布） 附图4页 CN 114949191 A 2022.08.30 CN 114949191 A 1.一种肿瘤疫苗， 其特征在于， 所述肿瘤疫苗包括肿瘤抗原和抗体， 蛋白重链氨基酸序 列如SEQ ID NO： 10所示， 轻链 氨基酸序列如SEQ  ID NO： 6所示。 2.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗， 其特征在于， 所述肿瘤疫苗通过断裂 内含肽的 反式剪接将肿瘤抗原与抗体结合得到， 所述肿瘤疫苗 为抗体偶联蛋白1G1 1‑LNM。 3.根据权利要求2所述的一种肿瘤疫苗， 其特 征在于， 所述断裂内含肽为GP41 ‑1。 4.根据权利要求1或2所述的一种肿瘤疫苗， 其特征在于， 所述肿瘤抗原为LNM， 通过 LAGE‑1、 NY‑ESO‑1和MAGE‑A3融合表达得到； 所述 抗体为PD‑L1抗体。 5.根据权利要求 4所述的一种肿瘤疫苗， 其特 征在于， 所述 抗体为1G1 1。 6.根据权利要求1 ‑5任一所述的一种肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 步骤一、 构建融合蛋白GB1 ‑IntC‑LNM表达载体， 随后制备得到融合蛋白GB1 ‑IntC‑LNM， 氨基酸序列如SEQ  ID NO： 9所示； 步骤二、 构建融合蛋白1G11 ‑IntN重链表达载体， 随后制备得到抗体融合蛋白1G11 ‑ IntN； 步骤三、 将融合蛋白GB1 ‑IntC‑LNM与抗体融合蛋白1G11 ‑IntN混合， 诱导催化断裂内含 肽GP41‑1反式剪接反应， 剪 接反应后， 得到所需肿瘤疫苗1G1 1‑LNM； 步骤一与步骤二无 先后顺序。 7.根据权利要求6所述的一种肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 步骤一中， 构建融合 蛋白GB1‑IntC‑LNM表达载体， 随后制备 得到融合蛋白GB1 ‑IntC‑LNM的步骤 包括： 1)通过使用BamH  I和NdeI双酶切质粒pUC57 ‑Kan‑GB1‑GP41IC和pET ‑30a(+)‑LNM， 分别 得到GB1‑IntC片段和线性化载体pET ‑30a(+)‑LNM， 然后使用T4连接酶， 采用T4连接方法构 建成融合蛋白GB1 ‑IntC‑LNM表达载体pET ‑30a(+)‑GB1‑IntC‑LNM； 2)将融合蛋白GB1 ‑IntC‑LNM表达载体pET ‑30a(+)‑GB1‑IntC‑LNM转化至BL21感受态细 胞中； 根据pET系统手册制备融合蛋白GB1 ‑IntC‑LNM， 纯化即得。 8.根据权利要求6所述的一种肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 步骤二中， 构建融合 蛋白1G11‑IntN重链表达载体， 随后制备 得到抗体融合蛋白1G1 1‑IntN的步骤 包括： 1)以pUC57 ‑Kan‑GP41IN为模板， 设计碱基序列如SEQ  ID NO： 3所示的Fc ‑IntN‑F引物和 碱基序列如SEQ  ID NO： 4所示的Fc ‑IntN‑R引物， 通过PCR扩增Fc ‑IntN基因片段， 然后凝胶 回收相应片段， 克隆至phIgG1 ‑1G11载体上的多克隆位点BamH  I与Hind  Ⅲ之间， 构建成可 表达融合蛋白1G11 ‑IntN的重链表达载体phIgG1 ‑1G11‑IntN， 氨基酸序列如SEQ  ID NO： 5所 示； 2)将融合蛋白1G11 ‑IntN的重链表达载体和1G11轻链表达载体phIgK ‑1G11以一定的质 量比共同转染2 93T细胞， 表达抗体融合蛋白1G1 1‑IntN。 9.根据权利要求6所述的一种肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 步骤三中， 所述肿瘤 疫苗的制备步骤 包括： 将融合蛋白GB1 ‑IntC‑LNM与抗体融合蛋白1G11 ‑IntN按一定的摩尔比混合， 加入DTT诱 导催化断裂内含肽GP41 ‑1发生反式剪接反应， 剪接 反应后， IntN剩余五个氨基酸残基TRSGY 与IntC的五个氨基酸残基SSSDV以肽键连接， 生 成抗体偶联蛋白1G11 ‑LNM， 得到所需肿瘤疫 苗。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114949191 A 210.根据权利要求9所述的一种肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 所述融合蛋白GB1 ‑ IntC‑LNM与抗体融合蛋白1G1 1‑IntN的摩尔比为1： 1.5 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114949191 A 3