(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221070495 6.4 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 长春科技学院 地址 130000 吉林省长 春市双阳区东 华街 1699号 (72)发明人 胡鹏飞　李吉萍　李春义　 (74)专利代理 机构 成都时誉知识产权代理事务 所(普通合伙) 5125 0 专利代理师 汪林 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) A61K 35/28(2015.01) A61K 31/7088(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方法、 及 在骨肉瘤治 疗中的应用 (57)摘要 本发明公开了工程化的鹿茸干细胞外泌体 和制备方法、 及在骨肉瘤治疗中的应用； 所述鹿 茸干细胞外泌体负载有miR ‑143； 其制备方法包 括以下步骤： 选取鹿茸的间充质组织， 经过预处 理后培养鹿茸干细胞， 向培育有鹿茸干细胞的培 养基中加入miR ‑143的慢病毒悬液进行培育， 得 到携带miR ‑143的鹿茸干细胞； 将培育的携带 miR‑143的鹿茸干细胞置于离心管中， 经过超高 速离心后， 得到外泌体进行低温保存； 本发明提 供一种携带miR ‑143的鹿茸干细胞外泌体， 提高 miR‑143在骨肉瘤中的表达， 有效抑制骨肉瘤。 权利要求书1页 说明书5页 CN 115386542 A 2022.11.25 CN 115386542 A 1.工程化的鹿茸干细胞外泌体， 其特 征在于： 所述鹿茸干细胞外泌体负载有miR ‑143。 2.工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 培养鹿茸干细胞 S11、 选取鹿茸的间充质组织， 洗去血污， 将其切割成碎块， 将所述碎块洗涤干净后置于 离心管中， 离心收集 沉淀A； S12、 将所述沉淀A进行消化处理， 消化处理后加入DMEM原代培养液进行洗涤， 其后 离心 收集沉淀B； S13、 将所述沉淀B均匀涂在细胞培养瓶底部， 倒 置培养瓶并加入DMEM原代培养液， 置于 细胞培养箱中培养， 其后正置培养瓶继续静置培养， 其后将细胞进行胰蛋白酶消化， 冻存， 获得原代鹿茸干细胞； S14、 将所述原 代鹿茸干细胞在 传代培养基上进行传代培 养， 得到鹿茸干细胞； S15、 取新鲜培养基， 将所述鹿茸干细胞接种于所述新鲜培养基上， 并向所述新鲜培养 基中加入miR ‑143的慢病毒悬 液进行培 育， 得到携带miR ‑143的鹿茸干细胞； S2、 分离外泌体 将培育的携带miR ‑143的鹿茸干细胞置于离心管中， 在4℃下， 经过300r/min离心 15min； 取上清液置于新的离心管中， 在4℃、 2000r/min下离心15min； 取上清液置于新的离 心管中， 在4℃、 20000r/min下离心30min； 取上清液置于新的超速离心管中， 在4℃、 100000r/min下离心2h； 收集沉淀， 经过无菌PBS重悬， 在经过无菌滤膜过滤后， 得到外泌体 进行低温保存。 3.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法， 其特征在于： 步骤 S11中所述鹿茸选用生长周期为30 ‑40天的鹿茸， 所述碎块的体积为0.6 ‑0.8 mm3， 所述碎块 的添加量 为3‑4g， 离心操作为在120 0r/min离心4mi n。 4.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法， 其特征在于， 步骤 S12的所述消化处理为： 向所述沉淀A中加入30ml消化液， 在40℃下振 荡消化， 在所述碎 块边 缘出现毛刷样毛边时， 停止消化， 并在1200r/min下离心4min， 弃上清； 所述DMEM的加量为 10mL； 所述离心操作为在120 0r/min下离心4mi n。 5.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法， 其特征在于： 步骤 S13中所述DMEM原代培养液的添加量为2 ‑3mL， 培养条件为36℃、 5％CO2， 培养时间为4h； 当 细胞达到70‑75％汇合时进行胰蛋白酶消化处 理。 6.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法， 其特征在于： 步骤 S14中所述鹿茸干细胞为所述原 代鹿茸干细胞传代至 3‑5代的鹿茸干细胞。 7.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法， 其特征在于： 步骤 S15中， 所述 新鲜培养基为RPMI1640 培养基， 培养条件为3 6℃、 5％CO2。 8.工程化的鹿茸干细胞外泌体在骨肉瘤治疗中的应用， 其特征在于： 将所述鹿茸干细 胞外泌体应用于骨肉瘤治疗的药物组合物、 药盒或药物制品中， 所述鹿茸干细胞外泌体携 带miR‑143。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386542 A 2工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方 法、 及在骨肉瘤治疗中 的应用 技术领域 [0001]本发明涉及肿瘤治疗技术领域， 具体是工程化的鹿茸干细胞外泌体和制 备方法、 及在骨肉瘤治疗中的应用。 背景技术 [0002]骨肉瘤也叫成骨肉瘤， 是较常见的发生在20岁以下的青少年或儿童的一种恶性骨 肿瘤， 在小儿骨恶性肿瘤中最多 见， 约为小儿肿瘤的5%。 骨肉瘤是骨 恶性肿瘤中最多 见的一 种， 是从间质细胞系发展而来， 肿瘤迅速生长是 由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤 骨样组织和骨组织。 下肢负重骨在外界因素 （如病毒） 的作用下， 使细胞突变， 可能与骨肉瘤 形成有关。 典型的骨肉瘤 源于骨内， 另一与此完全不同类型的是与骨皮质并列的骨肉瘤， 源 于骨外膜和附近的结 缔组织。 后者较少见， 预后稍好。 [0003]骨肉瘤目前仍是儿童和青少年恶性肿瘤死亡率很高的疾病， 但早期发现和及时治 疗已经从很大程度上提高了该病的生存率。 研究发现mi R‑143是一种抑癌因子， 但 其在骨肉 瘤中的表达受到 了显著抑制。 发明内容 [0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备 方法、 及在骨肉瘤 治疗中的应用， 提供一种携带miR ‑143的鹿茸干细胞外泌体， 提高miR ‑143 在骨肉瘤中的表达， 有效抑制骨肉瘤。 [0005]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 工程化的鹿茸干细胞外泌体， 所述 鹿茸干细胞外泌体负载有miR ‑143， 所述miR ‑143的表达水平为80 0‑1700copy/ μL。 [0006]本发明将 所述鹿茸干细胞外泌体应用于骨肉瘤治疗的药物组合物、 药盒或药物制 品中， 通过所述鹿茸干细胞外泌体负载miR ‑143来提高其在骨肉瘤的中的表达， 显著 提高其 对骨肉瘤的抑制效果， 并对 所述miR‑143的表达水平进 行限定， 使其能够在最大水平内实现 对骨肉瘤的抑制以及增强问题免疫的双重功能。 [0007]所述工程 化的鹿茸干细胞外泌体的制备 方法， 包括以下步骤： S1、 培养鹿茸干细胞 S11、 选取鹿茸的间充质组织， 洗去血污， 将 其切割成碎块， 将所述碎块洗涤干净后 置于离心管中， 离心收集 沉淀A； S12、 将所述沉淀A进行消化 处理， 消化 处理后加入DMEM原代培养液进行洗涤， 其后 离心收集 沉淀B； S13、 将所述沉淀B均匀涂在细胞培养瓶底部， 倒置培养瓶并加入DMEM原代培养液， 置于细胞培养箱中培养， 其后正置培养瓶 继续静置培养， 其后 将细胞进 行胰蛋白酶消化， 冻 存， 获得原 代鹿茸干细胞； S14、 将所述原 代鹿茸干细胞在 传代培养基上进行传代培 养， 得到鹿茸干细胞；说　明　书 1/5 页 3 CN 115386542 A 3