(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210692258.7 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 中国医学 科学院放射医学研究所 地址 300000 天津市南 开区白堤路238号 (72)发明人 何宁宁　宋会娟　刘强　徐畅　 孙晓辉　杨蒙蒙　张曼曼　纪凯华　 陆欣然　 (74)专利代理 机构 天津盈佳知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 12224 专利代理师 安娜 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/09(2010.01) A61K 47/69(2017.01)A61K 47/62(2017.01) A61K 41/00(2020.01) A61K 31/713(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (54)发明名称 用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体、 制备方 法、 应用 (57)摘要 本发明公开了用于肿瘤放疗增敏的工程化 外泌体、 制备方法、 应用， 所述外泌体其外修饰肿 瘤靶向肽， 其内包裹小干扰RNA核 酸药物， 所述外 泌体为脐带来源的间充质干细胞的外泌体， 所述 外泌体通过基因工程方法修饰肿瘤靶向多肽 iRGD。 本发明的有益效果是， 本发明旨在通过基 因工程手段在脐带来源的间充质干细胞外泌体 表面修饰肿瘤靶向肽iRGD， 使得改造后的外泌体 与高表达整合素的肿瘤细胞相结合， 从而增强其 主动靶向性。 利用这种工程化的外泌体， 可高效 地将STAT3基因的siRNA靶向运送至肿瘤组织， 从 而通过降低肿瘤细胞STAT3表达抑制肿瘤生长， 增强放疗 敏感性， 为治疗临床肿瘤病人放疗抵抗 提供新的思路。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 115029320 A 2022.09.09 CN 115029320 A 1.一种用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体， 其特征在于， 所述用于肿瘤放疗增敏的工 程化外泌体外 部修饰肿瘤靶向肽， 内部包裹小干扰RNA核酸药物。 2.根据权利要求1所述的用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体， 其特征在于， 所述核酸药 物是长度为15 ‑30个核苷酸。 3.根据权利要求2所述的用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体， 其特征在于， 所述核酸药 物为siRNA、 micro  RNA、 shRNA或ASO。 4.根据权利要求1所述的用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体， 其特征在于， 所述核酸药 物为靶向STAT3基因的siRNA或抑制肿瘤恶性相关基因： 如c ‑myc等的siRNA。 5.一种如权利要求1 ‑4任一项所述的用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体的制备方法， 特征在于， 所述制备 方法包括如下步骤， 目的基因表达载体GV49 2‑iRGD‑Lamp2b的构建； 稳定表达目的基因间充质干细胞系MSC ‑GV492‑iRGD‑Lamp2b的建立； 外泌体的提取， 将收集的MSC ‑GV492‑iRGD‑Lamp2b细胞的上清培养液提取外泌体， 得到 通过基因工程方法修饰有iRGD肽的外泌体； 修饰有iRGD肽的外泌体小干扰RNA的加载： 通过转染试剂对修饰有iRGD肽的外泌体进 行转染， 实现工程 化外泌体的制备。 6.一种如权利要求1 ‑4任一项所述的用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体在制备外泌体 对肿瘤细胞靶向性增强药物中的应用。 7.一种如权利要求1 ‑4任一项所述的用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体在制备抑制肿 瘤细胞生长， 增强辐射敏感性药物中的应用。 8.一种如权利要求1 ‑4任一项所述的用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体在制备放疗增 敏肿瘤靶向药物中的应用。 9.一种αvβ 3/αvβ 5高表达的肿瘤细胞， 其特征在于， 所述高表达αvβ 3/αvβ 5的肿瘤细胞 用于权利要求1 ‑4任一项所述的肿瘤放疗增敏的工程 化外泌体的药效功能。 10.一种用于验证权利要求1 ‑4任一项所述的用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体的药 效的动物模型构建方法， 其特 征在于， 所述动物模型构建方法包括： 裸鼠乳腺癌模型的建立： 将5 ×106个细胞接种于雌性Nu/Nu 裸鼠皮下， 10天后， 验证接种 是否成功； 取建模成功后的裸鼠尾静脉注射标记有NIR的外泌体， 在注射后的2， 24， 48h， 进 行近红外活体成像分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029320 A 2用于肿瘤放疗增敏的工 程化外泌体、 制备方 法、 应用 技术领域 [0001]本发明生物技术领域， 特别是用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体、 制备方法、 应 用。 背景技术 [0002]MSCs是一类具有 自我更新、 多向分化能力的多潜能祖细胞， 可以从成熟的组织中 获得， 主要来源包括脐带、 骨髓、 脂肪等， 由于其具有自我更新能力、 多潜能和免疫调节特 性， MSCs已成为医学领域中的一大研究热点。 MSC s在体内的作用机制很复杂， 越来越多研究 表明旁分泌机制是MSCs发挥功能的主要形式， 而外泌体则是旁分泌的主要物质， 由于其较 低的毒性、 免疫原性及不良反应， 在未来有望将外泌体作为一种 无细胞药物制剂应用于临 床治疗中。 [0003]外泌体(Exosomes， Exo)， 是直径介于30 ‑150nm之间， 具有磷脂双分子膜的纳米级 囊泡状结构。 膜内包含着大量生物活性物质， 如蛋白质、 mRNA、 microRNA、 多肽及脂类等， 是 细胞间交流和信息传递的重要媒介。 尽管siRNA作为一种极具前景的基因靶向药， 但siRNA 本身稳定性差， 目前核酸药物临床存在的最大问题， 在于缺 乏更好更有靶向性的体内递送 体系。 外泌体作为运输载体不仅具有高稳定性、 高选择性的优势， 并且其与核酸分子有更好 的亲和性， 能够显著提高包封和递送效率。 除此之外， 在最新的研究成果中， 外泌体还可以 透过血脑屏障发挥作用， 具有广阔的应用前景。 提高药物的靶向性有利于提高药物的疗效， 对MSCs外泌体进行合理修饰能使外泌体有效地靶向进入肿瘤部位， 发挥更强的抗癌作用。 [0004]信号转导与转录活化因子3(signal  transducers  and activators  of  transcription3,S TAT3)是信号传导与转录激活因子家族的重要成员。 STAT3在多种肿瘤组 织和细胞系中高表达， 且与肿瘤的增殖分化、 细胞凋亡密切相关。 如能设法阻断癌细胞内 STAT3基因的表达， 定会大大减弱癌细胞增殖能力同时减弱凋亡抑制。 因此， 靶向 阻断信号 通路中的某些分子可能是一种全新的独立有效的肿瘤治疗方法 [0005]通过上述分析， 现有技 术存在的问题及缺陷为： [0006]现有技术外泌体由于没有进一步改造， 使得肿瘤细胞的靶向性效果差。 而且现有 技术不能为外泌体实现对肿瘤的生长抑制以及放疗增敏的潜在药物提供理论依据。 发明内容 [0007]为克服相关技术中存在的问题， 本发明公开实施例提供了用于肿瘤放疗增敏的工 程化外泌体、 制备 方法、 应用。 [0008]所述技术方案如下： 一种用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体， 外部修饰肿瘤靶向 肽， 内部包裹小干扰RNA核酸药物； 所述肿瘤靶向肽的氨基酸序列为c(Cys ‑Arg‑Gly‑Asp‑ Lys‑Gly‑Pro‑Asp‑Cys)。 本发明创新的用脐带来源的间充质干细胞的外泌体经过改造， 使 外泌体膜表面带有肿瘤靶向肽， 里边含有siRNA， 用于放疗增敏， 就是在改造后的外泌体功 能具有新用途。说　明　书 1/7 页 3 CN 115029320 A 3