(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210678490.5 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 华东师范大学 地址 200241 上海市闵行区东川路5 00号 (72)发明人 江文正　郭丹丹　 (74)专利代理 机构 上海麦其知识产权代理事务 所(普通合伙) 31257 专利代理师 董红曼 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/62(2006.01) C07K 19/00(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和细胞 药物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种嵌合抗原受体NK细胞及 其制备方法和细胞药物 应用， 涉及CAR ‑NK细胞治 疗技术领域。 本发明所述NK细胞表达靶向肿瘤相 关抗原的嵌合抗原受体并且在所述嵌合抗原受 体NK细胞中GPR116基因被敲除或其表达受到抑 制。 本发明嵌合抗原受体NK细胞比原有的CAR ‑NK 细胞具有更强的肿瘤细胞杀伤能力， 为肿瘤治疗 提供了新的方向和思路。 权利要求书2页 说明书8页 序列表4页 附图4页 CN 114958770 A 2022.08.30 CN 114958770 A 1.一种嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述嵌合抗原受体NK细胞为表达靶向肿瘤 相关抗原并且GPR 116基因被敲除或其表达受到抑制的嵌合 抗原受体NK细胞。 2.根据权利 要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述GPR116基因的表达通 过如下分子中的任意一种或几种的组合被抑制： shRNA、 反义RNA、 siRNA和/或antagomir； 或 者， 所述嵌合抗原受体NK细胞的GPR116基因通过如下技术中的任意一种被敲除： CRISPR/ Cas9技术、 ZFN技术和/或TALEN 技术。 3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述嵌合抗原受体NK细胞 含有shRNA分子， 所述GPR 116基因的表达通过 所述shRNA分子受到抑制。 4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述shRNA分子的靶序列 如SEQ ID NO.1所示。 5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述shRNA分子的核苷酸 序列如SEQ  ID NO.13所示。 6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述肿瘤相关抗原选自 NKG2D配体； 所述嵌合 抗原受体的抗原结合结构域能够特异性结合所述肿瘤相关抗原。 7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 当所述肿瘤相关抗原为 NKG2D配体时， 所述 嵌合抗原受体的抗原结合结构域为NKG2D蛋白， 或者是选自NKG2D蛋白的 具有结合活性的片段。 8.根据权利要求6或7所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述NKG2D配体选自 MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP  2、 ULBP 3、 ULBP 4、 ULBP 5和ULBP 6中的任意 一种。 9.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述肿瘤相关抗原为 NKG2D配体， 所述抗原结合结构域 为选自NKG2D蛋白的胞外段。 10.根据权利 要求9所述的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 所述NKG2D蛋白的胞外段 的氨基酸序列如SEQ  ID NO.16所示。 11.根据权利要求6所述的嵌合 抗原受体NK细胞， 其特 征在于， 所述嵌合 抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区； 所述跨膜结构域选自： CD8、 CD28、 CD33、 CD37、 CD8α、 CD5、 CD16、 ICOS、 CD9、 CD22、 CD134、 CD137、 CD154、 CD19、 CD45、 CD4、 和CD3 ε 中的一种或多种的跨膜结构域。 12.根据权利要求1 1所述的嵌合 抗原受体NK细胞， 其特 征在于， 所述跨膜结构域选自CD 8的跨膜结构域； 和/或， 所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域， 所述共刺激分子选自： CD27、 CD3ζ、 CD3γ、 CD3δ、 CD3ε、 CD5、 CD22、 CD79a、 CD79b、 CD66d、 CD2、 CD4、 CD5、 CD28、 CD30、 CD40、 CD134、 CD137、 ICOS、 CD154、 4 ‑1BB、 OX40、 CD7、 L IGHT、 NKG2C和B7 ‑H3中的一种或多种； 和/或， 所述共刺激信号传导区包括 4‑1BB的细胞内结构域和CD3ζ 的细胞内结构域。 13.一种制备如权利要求1 ‑12之任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞的方法， 其特征在 于， 其包括如下步骤： 抑制嵌合抗原受体NK细胞的GPR116基因的表达或敲除所述嵌合抗原 受体NK细胞的GPR 116基因。 14.一种细胞药物， 其特征在于， 其含有作为活性成分的如权利要求1 ‑12之任一项所述 的嵌合抗原受体NK细胞以及药 学上可接受的辅料。 15.一种GPR116基因表达的干扰剂或抑制剂， 其特征在于， 其可干扰或抑制GPR116基因权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114958770 A 2的表达； 所述干扰剂或抑制剂为shRNA、 反义RNA、 siRNA和/或antagomir分子中的任意一种 或几种的组合。 16.如权利要求1 ‑12之任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞、 如权利要求14所述的细胞 药物、 或如权利要求15所述的干扰剂或抑制剂在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用、 在 CAR‑NK治疗中的应用。 17.如权利要求16所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤选自实体瘤或非实体瘤； 和/或， 所述实体瘤为特异性表达NKG2D配体的肿瘤； 和 /或， 所述实体瘤选自胰腺癌、 前列腺癌、 肝 癌、 直肠癌、 胃癌、 和乳腺癌中的任意 一种。 18.如权利 要求16所述的应用， 其特征在于， 通过构 建所述靶向实体肿瘤的NKG2D ‑CAR‑ NK细胞， 并且共表达能够提高CAR ‑NK细胞抗肿瘤能力干扰基因GPR116， 提高NKG2D ‑CAR‑NK 细胞的抗肿瘤能力； 所述NKG2D ‑CAR‑NK细胞靶向治疗胰腺癌； 和/或， 通过在NK92细胞中下 调GPR116基因， 促进NK92细胞杀伤能力； 和/或， 通过干扰GP R116表达来增强NKG2D ‑CAR‑NK 细胞的抗肿 瘤功能； 和/或， 利用所述干扰剂或抑制剂的RNA干扰的方法法在CAR ‑NK细胞中 敲低GPR116基因的表达 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114958770 A 3