(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210679872.X (22)申请日 2022.06.15 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属协和 医院 地址 430022 湖北省武汉市解 放大道127 7 号 (72)发明人 浦飞飞　景豆豆　吴蔚　彭一中　 于一涵　陈烜左　张志才　刘建湘　 吕潇　邵增务　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 菅士腾 (51)Int.Cl. C07D 311/30(2006.01) C07D 311/40(2006.01)A61K 47/69(2017.01) A61K 47/54(2017.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61K 36/748(2006.01) (54)发明名称 一种从白花蛇舌草中提取槲皮素的方法及 其脂质体的制备方法和脂质体产品 (57)摘要 本发明公开了一种从白花蛇舌草中提取槲 皮素的方法及其脂质体的制备方法和脂质体产 品， 涉及骨 肉瘤治疗药物领域。 该提取槲皮素的 方法， 包括： 将白花蛇舌草粉碎后， 用95％乙醇进 行浸提， 得到粗提取溶液； 所述粗提取溶液经聚 酰胺柱层析色谱分离纯化， 得到所述槲皮素。 该 制剂方法包括： 将按照上述方法提取得到的槲皮 素与卵磷脂、 脑磷脂、 胆固醇、 聚乙二醇和叶酸混 合， 之后与氯仿混合， 之后溶解于二甲基亚砜中， 再经真空干燥后和水合反应， 最后经超声波破碎 和微滤， 得到槲皮素脂质体。 本发明的方法使槲 皮素溶解度更高， 稳定性更好， 同时降低其毒 性； 利用叶酸修饰槲皮素使其靶向效率更好， 提高其 对骨肉瘤的增殖、 侵 袭和免疫逃逸的抑制。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 114989124 A 2022.09.02 CN 114989124 A 1.一种从白花蛇舌 草中提取槲皮素的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)将白花蛇舌 草粉碎后， 用95％乙醇进行浸提， 得到粗 提取溶液； (2)所述粗提取溶液经聚酰胺 柱层析色谱分离纯化， 得到所述 槲皮素。 2.根据权利要求1所述的从白花蛇舌草中提取槲皮素的方法， 其特征在于， 在步骤(1) 中， 粉碎后的白花蛇舌 草与95％乙醇的质量比为1:40 。 3.根据权利要求1所述的从白花蛇舌草中提取槲皮素的方法， 其特征在于， 在步骤(1) 中， 所述浸提 为在90℃条件下提取180mi n。 4.根据权利要求1所述的从白花蛇舌草中提取槲皮素的方法， 其特征在于， 所述 聚酰胺 柱层析色谱分离纯化的具体操作包括： (1)聚酰胺预处理： 取聚酰胺， 用95％乙醇浸泡10min， 不断搅拌， 待完全去除气泡后装 入柱中， 再用400mL的95％乙醇洗脱， 洗至洗脱液透明， 之后， 依次用250mL的5％NaOH水溶 液、 100mL的蒸馏水、 25 0mL的10％醋酸水 溶液洗脱， 最后用蒸馏水洗脱至pH中性； (2)上样： 按照每10 0mL聚酰胺加入1.5 ‑2.5g所述 粗提取溶液上样； (3)洗脱： 先依次用体积分数为10％、 30％、 50％、 70％、 95％的乙醇水溶液洗脱， 再依次 用氯仿与甲醇体积比分别为20:1、 10:1、 5:1、 2:1和1:1 的氯仿‑甲醇混合溶液洗脱； 最后用 石油醚和乙酸乙酯体积比分别为20:1、 10:1、 5:1、 2:1和1:1的石油醚 ‑乙酸乙酯混合溶液洗 脱； (4)浓缩： 石油醚和乙酸乙酯体积比为10:1的石油醚 ‑乙酸乙酯的洗脱液真空干燥， 得 到所述槲皮素。 5.一种槲皮素脂质体的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： a根据权利要求1所述的方法制备 得到槲皮素； b将步骤a制备得到的槲皮素与卵磷脂、 脑磷脂、 胆固醇、 聚乙二醇和叶酸混合， 得到混 合液1， 所述混合液1再与氯仿 混合得到 混合液2， 所述混合液2溶解于二甲基亚砜中， 得到 混 合液3； c所述混合液3经真空干燥后， 加入PBS液进行 水合反应得到混合液4； d所述混合液4经超声 波破碎后， 用微 孔滤膜过 滤得到所述 槲皮素脂质体。 6.根据权利要求5所述的槲皮素脂质体的制备方法， 其特征在于， 在步骤b中， 所述槲皮 素、 所述卵磷脂、 所述脑磷脂、 所述胆固醇、 所述聚乙二醇和所述叶酸的质量比为6:9:5:4: 1:1。 7.根据权利要求5所述的槲皮素脂质体的制备方法， 其特征在于， 在步骤c 中， 所述水合 反应的条件为 4℃。 8.根据权利要求5所述的槲皮素脂质体的制备方法， 其特征在于， 在步骤d中， 所述超声 波破碎的频率 为20KHz， 时间为1.5 h。 9.根据权利要求5所述的槲皮素脂质体的制备方法， 其特征在于， 在步骤d中， 所述微孔 滤膜的孔径为2 20nm。 10.一种根据权利要求5 ‑9任一项所述的制备 方法制备 得到的槲皮素脂质体。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114989124 A 2一种从白花 蛇舌草中提取槲皮素的方 法及其脂质体的制备方 法和脂质体产品 技术领域 [0001]本发明涉及骨肉瘤治疗药物领域， 特别是涉及一种从白花蛇舌草中提取槲皮素的 方法及其脂质体的制备 方法和脂质体产品。 背景技术 [0002]骨肉瘤高发于 15‑19岁， 是青少年和儿童最易发生的一种恶性骨肿瘤， 大约40％的 患者在发现时就已经发生了转移， 传统的治疗手段不能达到预期， 预后并不乐观。 近年来， 即使新型辅助化疗技术和手术手段不断进步， 骨肉瘤患者的5年生存率仍仅为70％。 对于化 疗不耐受或肿瘤晚期的患者， 目前尚无有效的应对手段。 因此， 探索骨肉瘤治疗的新策略， 改善患者的预后， 就成了一个严肃且急需解决的课题。 [0003]免疫治疗一直是骨肉瘤临床和基础研究的热点， 对检查点蛋白抑制剂的研究更是 备受关注。 在肿瘤的发生和发展过程中， 免疫系统在某些阶段不仅会消灭肿瘤细胞， 也会促 进肿瘤细胞的免疫逃逸。 相关研究已经表明， 通过阻断特定检查点， 可实现免疫调控作用， 完成对肿瘤尤其是实体肿瘤的治疗。 免疫检查点抑制剂可抑制免疫检查点活性， 重新激活T 细胞对肿瘤的免疫应答效应， 从而达到抗肿瘤的作用。 深入研究免疫检查点及其抑制剂的 作用机制， 将为肿瘤的免疫 治疗提供新的思路和方向。 [0004]在现有的技术中， 选用的骨肉瘤抑制剂通常是传统的共价结合靶点， 共价修饰类 药物通常含有 亲电性基团或者能够经体内代谢产生亲电基团， 通过共享电子的方式与靶标 亲核部位结合形成复合物， 从而使靶标失活， 发挥药理作用。 其与靶标常通常不可逆， 因为 其亲电性较强的缘故， 对亲核基团缺 乏足够的选择性， 往往容易产生非特异性结合而出现 脱靶效应， 在体内产生诸多不良反应甚至毒性反应， 造成组织损伤或免疫反应。 [0005]槲皮素是一种具有生物活性的类黄酮， 可以发挥非常广泛的生物学效应， 它存在 于植物皮、 花、 叶、 芽、 种子、 果实中， 是一种非共价的肿瘤抑制剂， 这使 得它成为了骨肉瘤 治 疗重要的研究点与新的希望。 但在人体内， 由于其与白蛋白之 间存在氢键作用， 槲皮素存在 低吸收、 清除快、 副作用大的问题， 这严重限制了槲皮素的生物学功能。 其不溶于水的性质， 进一步限制了其临床应用。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供一种从白花蛇舌草中提取槲皮素的方法及其脂质体的制备 方法和脂质体产品， 以解决上述现有技术存在的问题， 使槲皮素溶解度更高， 稳定性更好， 同时降低其毒性； 利用叶酸修饰槲皮素使其靶向效率更好， 提高其对骨肉瘤的增殖、 侵袭和 免疫逃逸的抑制。 [0007]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0008]本发明提供一种从白花蛇舌 草中提取槲皮素的方法， 包括以下步骤： [0009](1)将白花蛇舌 草粉碎后， 用95％乙醇进行浸提， 得到粗 提取溶液；说　明　书 1/7 页 3 CN 114989124 A 3