(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210933323.0 (22)申请日 2022.08.04 (71)申请人 深圳赛保尔生物药业有限公司 地址 518129 广东省深圳市龙岗区坂田街 道雅园路14 号 (72)发明人 郑华淦　廖冬　杨艳群　曲和之　 (74)专利代理 机构 北京精金石知识产权代理有 限公司 1 1470 专利代理师 张黎 (51)Int.Cl. G01N 1/28(2006.01) G01N 1/38(2006.01) G01N 33/18(2006.01) (54)发明名称 一种测定低分子量 肝素浓度的方法 (57)摘要 本发明属于低分子量肝素生产技术领域， 具 体涉及一种测定低分子量肝素浓度的方法。 本发 明提供的测定低分子量肝素浓度的方法是将样 品加纯化水溶解并稀释制成不同浓度的梯度溶 液， 用TOC分析仪测定不同浓度样品的TOC值， 绘 制TOC与样品浓度的校准曲线， 得到线性方程。 接 着采用TOC分析仪测定生产过程中中间品溶液的 TOC值， 用线性方程计算产品的浓度。 本发明提供 的测定低分子量肝素浓度的方法具有操作 简单， 检测时间短， 准确性高等特点， 适用于达肝素钠 或那屈肝素钙制备过程中产品浓度的快速检测， 以便于进行浓度控制， 并使 最终产品质量符合EP 标准要求。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 115356172 A 2022.11.18 CN 115356172 A 1.一种测定低分子量 肝素浓度的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤S1： 取样品， 加纯化水 溶解并稀释制成不同浓度的梯度溶 液， 得样品溶 液； 步骤S2： 采用TOC分析仪测定步骤S1制得的样品溶液的TOC值， 每个样品溶液平行测定2 次， 绘制TOC ‑样品浓度校准曲线， 得 出线性方程； 步骤S3： 在制备低分子量肝素过程中， 测定待测溶液的TOC值， 用步骤S2中的线性方程 计算待测溶液中低分子量肝素 的浓度， 必要时继续超滤或补加水， 将待测溶液 的浓度控制 在一定范围内， 以使最终产品质量符合EP标准要求。 2.如权利要求1所述的测定低分子量肝素浓度的方法， 其特征在于， 所述步骤S1中的样 品是指达肝素钠或那屈肝素钙成品， 所述步骤S 3中的待测溶液是指 达肝素钠或那屈肝素钙 制备过程中的超滤透过 液和醇沉前的产品溶 液。 3.如权利要求1所述的测定低分子量肝素浓度的方法， 其特征在于， 所述步骤S1中的样 品溶液指浓度为： 5mg/L、 10mg/L、 15mg/L、 20mg/L、 25mg/L的梯度溶 液。 4.如权利要求1所述的测定低分子量肝素浓度的方法， 其特征在于， 所述步骤S2中的 TOC分析仪为GE  Sievers M9型TOC分析仪 。 5.如权利要求1所述的测定低分子量肝素浓度的方法， 其特征在于， 所述步骤S2、 S3中 的TOC分析仪的测定条件为： 酸剂设为0.3～0.6mL， 氧化剂设为0.3～0.6mL， 冲洗时间＞ 300s， 系统适用性核查响应效率范围位于85％～1 15％。 6.如权利要求5所述的测定低分子量肝素浓度的方法， 其特征在于， 所述酸剂为5～ 8mol/L的磷酸溶 液。 7.如权利要求5所述的测定低分子量肝素浓度的方法， 其特征在于， 所述氧化剂为质量 百分比浓度为10～ 20％的过硫酸铵溶 液。 8.如权利要求1所述的测定低分子量肝素浓度的方法， 其特征在于， 所述步骤S3 中将待 测溶液的浓度控制在一定范围内， 是指在超滤后期当透过液中产品浓度下降到0.2～ 1.0mg/mL时， 停止补水， 开始浓缩， 此时小分子片段已去除至合理范围内， 可使最终产品的 分子量分布合格。 9.如权利要求1所述的测定低分子量肝素浓度的方法， 其特征在于， 所述步骤S3 中将待 测溶液的浓度控制在一定范围内， 是指在醇沉前将产品浓度控制在0.12～0.20g/mL范围 内， 进行醇沉、 离心、 干燥， 可使最终产品的乙醇含量 合格。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115356172 A 2一种测定低分子量肝素浓度的方 法 技术领域 [0001]本发明属于低分子量肝素生产技术领域， 具体涉及一种测定低分子量肝素浓度的 方法。 背景技术 [0002]肝素是一种硫酸化糖胺聚糖类化合物， 主要是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生， 分子结构极其复杂， 由葡萄糖胺， L ‑艾杜糖醛苷、 N ‑乙酰葡萄糖胺和D ‑葡萄糖醛酸交替组 成。 目前， 普通肝素都是从猪小肠粘膜中提取、 精制得到， 主要用于预防和治疗血栓栓塞性 疾病以及血 液透析抗凝 。 [0003]低分子量肝素是由普通肝素经化学法或酶法裂解制备而得的， 其具有更高的抗 FXa/抗FⅡa效价比， 出血的副作用更小， 在临床上得到更广泛的应用。 欧洲药典(EP)按照不 同生产工艺将低分子量肝素分为那屈肝素钙、 达肝素钠、 依诺肝素钠、 帕肝素钠和汀肝素 钠， 不同方法制备的低分子量 肝素， 其分子量分布及末端结构不同， 具有不同的理化特性。 [0004]达肝素钠和那屈肝素钙 是通过亚硝酸裂解法制备而得， 该方法制备的产品不含碳 碳双键结构， 因此无紫外吸收， 难以直接测定中间品溶液中的产品浓度。 目前， 传统的凝胶 排阻层析色谱法， 结合GPC软件计算， 也只能测 定达肝素钠、 那屈肝素钙的分子量与分子量 分布， 而无法测定其浓度。 [0005]专利文献CN103 149170A公开了一种邻菲罗啉 ‑硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙 的溶液浓度的方 法， 其是通 过测定Zn2+离子、 邻菲罗啉和那屈肝素钙三者混合 溶液的紫外吸 光度来测定产品浓度。 张云等人在 “紫外分光光度法测定肝素含量的研究 ”文章中指出， 亚 甲蓝可与肝素发生络合反应， 在664nm处产生特征峰， 然后可用分光光度法测 定肝素浓度。 司文会等人在 “夜蓝褪色分光光度法测定肝素钠 ”文章中指出， 在pH4.5的乙酸 ‑乙酸钠缓冲 溶液中， 肝素钠与夜蓝 之间相互作用使夜蓝褪 色， 可于618nm处用分光光度法测定肝素钠 浓 度。 [0006]虽然上述方法均可以测定肝素的浓度， 但是均具有操作繁琐， 检测时间长， 线性范 围小， 易受干扰等缺点。 在制备达肝素钠、 那屈肝素钙的过程中， 需及时测定超滤透过液和 醇沉前料液 的产品浓度， 因为在超滤时会有一些小分子肝素透过滤膜而去除， 需合理控制 超滤终点， 若超滤时间不够， 透过液产品浓度较高， 可能最终产品的小分子含量偏多； 如果 超滤时间过久， 小分子去除太彻底， 透过液浓度很低， 可能最终产品的小分子含量太低， 重 均分子量偏 高， 而且产品收率变低。 此外， 按照以往经验， 醇沉前需将料液的产品浓度控制 在一定范围内， 才能使沉淀的颗粒大小在适宜范围内， 便于在干燥时去除乙醇。 若浓度过 低， 则颗粒过细， 离心后产品较粘， 湿重大， 携带的乙醇和水分大大增多， 不利于干燥； 若浓 度过高， 则沉淀颗粒较大， 干燥过程中不利于乙醇向外扩散。 因此， 研究和开 发出一种快速、 准确地测定低分子量肝素产品浓度的方法， 进行后续工艺控制， 并使最终产品质量符合EP 标准要求， 仍是目前 未解决的难题。说　明　书 1/7 页 3 CN 115356172 A 3