ICS 65.120 CCS B 46 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2037—2020 饲料中色氨酸的测定 微波水解-氨基酸自动分析仪法 Determination of tryptophan in feeds microwave hydorolysis-amino acid automatic analyzer method 2020-11-30 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-12-30 实施 发 布 DB15/T 2037—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：宋洁、姚一萍、王丽芳、史培、冯小慧、王雪娇、张三粉、狄彩霞、景宇鹏、 羿静、钟华晨、郭晨阳、云伏雨。 I DB15/T 2037—2020 饲料中色氨酸的测定 微波水解-氨基酸自动分析仪法 1 范围 本文件规定了饲料中色氨酸含量测定的微波水解-氨基酸自动分析仪法。 本文件适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中色氨酸的测定。 本方法定量限：0.05 %（质量分数） 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6433 饲料中粗脂肪的测定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 饲料中色氨酸经微波碱水解后，从蛋白链中释放出来，经氨基酸自动分析仪测定色氨酸含量。 5 试剂和材料 5.1 如无特别说明，本文件所用试剂均为分析纯试剂,水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.2 氢氧化钠。 5.3 盐酸：浓度≥36 %，优级纯。 5.4 柠檬酸。 5.5 柠檬酸钠。 5.6 硼酸。 5.7 乙醇。 1 DB15/T 2037—2020 5.8 氢氧化钠溶液 （500 g/L） ：称取 50 g 氢氧化钠，溶于 50 mL 水中，冷却至室温后，定容至 100 mL， 混匀。 5.9 氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：称取 0.40 g 氢氧化钠，定容至 100 mL 水中，混匀。 5.10 氢氧化钠溶液（5 mol/L）：称取 200 g 氢氧化钠，溶于 200 mL 水中，冷却至室温后，定容至 1000 mL，混匀。 5.11 盐酸溶液（6 mol/L）：取 500 mL 盐酸加水定容至 1000 mL，混匀。 + 5.12 柠檬酸钠缓冲溶液（0.12 mol/L Na ，pH=3.45）：分别称取 11.8 g 柠檬酸钠和 6.0 g 柠檬酸， 溶于 500 mL 水中，加入乙醇 65 mL，浓盐酸 5.6 mL，用水定容至 1000 mL，混匀，用 6 mol/ L 盐酸溶 液（5.10）或 500 g/L 氢氧化钠溶液（5.7）调节 pH 至 3.45，加辛酸 0.1 mL。 + 5.13 柠檬酸钠缓冲溶液（0.2 mol/L Na ，pH=10.85）：称取 19.6 g 柠檬酸钠，3.1 g 氢氧化钠，5.0 g 硼酸，溶于 500 mL 水中，用水定容至 1000 mL，混匀，用 6 mol/ L 盐酸溶液或 500 g/L 氢氧化钠溶 液调节 pH 至 10.85，加入辛酸 0.1 mL。 5.14 L-色氨酸标准品：纯度不小于 99 %。 5.15 L-色氨酸标准储备液（1.0 μ mol/mL）：精确称取 20.4 mg 色氨酸标准品，加适量水和数滴 0.1 mol/L 的氢氧化钠（5.8）溶解，用水定容至 100 mL，4 ℃冷藏保存，有效期 1 个月。 5.16 L-色氨酸标准工作液（0.1 μ mol/mL）：准确吸取 1.0 mL 色氨酸标准储备溶液于 10.0 mL 容量 瓶中，用水稀释至刻度，为色氨酸标准上机液，4 ℃冷藏保存，有效期 2 周。 5.17 针式过滤器：0.45 μ m 水性膜。 6 仪器设备 6.1 氨基酸自动分析仪。 6.2 微波消解仪：温度不小于 180 ℃。 6.3 天平：感量分别为 0.01 g 和 0.0001 g。 6.4 离心机：转速不低于 10000 r/min。 6.5 聚四氟乙烯消解管：容积不小于 50 mL。 6.6 pH 计。 7 分析步骤 7.1 试样制备 按照GB/T 14699.1抽取有代表性试样，四分法缩分制样。按GB/T 20195制备试样，粉碎后过0.25 mm 孔径筛，充分混匀后装入密封容器中备用。脂肪含量大于4 %的试样，按照GB/T 6433先进行脱脂处理。 7.2 试样水解 2 DB15/T 2037—2020 准确称取0.05 g～0.1 g（精确至0.0001 g）脂肪含量小于4 %的试样，置于聚四氟乙烯消解管中， 加入5 mL氢氧化钠溶液（5.9），充氮气1 min，旋紧密封盖后放入微波消解仪中进行微波水解。水解条 件：功率1200 w，升温时间10 min，水解温度170 ℃，水解时间30 min。取出消解管，冷却至室温，将 水解液转移至25 mL容量瓶，用6 mol/L盐酸（5.10）中和，使pH至中性，并用水定容至刻度，10000 r/min 离心10 min，经0.45 μ m针式过滤器过滤后用氨基酸自动分析仪测定。 7.3 氨基酸自动分析仪色谱条件 氨基酸自动分析仪工作条件和洗脱梯度见表1和表2。 表1 氨基酸自动分析仪工作条件 仪器条件 仪器参数 色谱柱 流动相 检测波长（nm） 流动相流速（mL/min） 茚三酮流速（mL/min） 反应器温度（℃） 柱温（℃） 进样体积（μ L） LCA K06/Na（4.6×150 mm） 柠檬酸钠 A：0.12 mol/L，pH=3.45；B=0.2 mol/L，pH=10.85 570 0.45 0.25 130 74 50 注：可按照不同氨基酸分析仪的最佳工作条件进行优化。 表2 氨基酸自动分析仪洗脱梯度 时间 A B C D 流速 （min） （%） （%） （%） （%） （mL/min） 1 初始 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45 2 15.0 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45 3 15.1 0.0 0.0 0.0 100.0 0.45 4 18.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.45 5 18.1 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45 6 30.1 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45 7 30.2 30.0 70.0 0.0 0.0 0.00 序号 注：A 为 0.12 mol/L 柠檬酸钠缓冲液；B 为 0.2 mol/L 柠檬酸钠缓冲液；D 为 20 g/L NaOH 溶液。 7.4 测定 根据氨基酸自动分析仪色谱条件调整好氨基酸自动分析仪参数，依次吸入0.1 μ mol/mL色氨酸标准 工作液（5.15）和制备好的试样水解液，采用外标法单点校正测定试样中色氨酸含量。 7.5 平行试验 按7.2~7.4步骤对同一试样进行平行测定。 7.6 空白试验 除不称取试样外，均按7.2~7.4步骤进行测定。 3 DB15/T 2037—2020 8 结果计算 试样中色氨酸含量按式（1）计算： Xi  Ai  cs  M  V 100 .................................................................. (1) As  m 106 式中： X i ——试样中色氨酸质量分数，单位为%； Ai ——试样测定液色氨酸的峰面积； cs ——色氨酸标准工作液的含量，单位为微摩尔每毫升（μ mol/mL）； M ——色氨酸的摩尔质量，为204.2，单位为微克每微摩尔（μ g/μ mol）； V ——试样稀释体积，单位为毫升（mL）； As ——色氨酸标准工作液的峰面积； m ——称样量，单位为克（g）。 计算结果以算术平均值表示，结果精确至小数点后两位小数。 脱脂试样的计算结果根据脱脂率折算成原样结果。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的12 %。 4