ICS 65.020.20 B 16 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4101—2020 苹果轮纹病菌快速检测方法 Rapid detection of botryosphaeria dothidea 2020 - 08 - 31 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 10 - 01 实施 发 布 DB37/T 4101—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省烟台市农业科学研究院。 本标准主要起草人：王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。 I DB37/T 4101—2020 苹果轮纹病菌快速检测方法 1 范围 本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。 -7 本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限：10 ng/μL苹果轮 纹病菌DNA。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 原理 3.1 扩增原理 根据苹果轮纹病菌的ITS序列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对，特异性序列参 见附录A。三对引物特异性识别靶标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ITS基 因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物， 加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。 3.2 显色液显色原理 SYBR Green I是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链 DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不 发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大 幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 LAMP：环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） ITS：内转录间隔区（Internal transcribed spacer） 2×Lamp Master Mix：等温扩增PCR混合液 Bst酶：Bst DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase） 5 试剂和材料 1 DB37/T 4101—2020 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T 6682中规定的一级水。 1) 5.1 等温扩增 PCR 混合液（2×Lamp PCR Master Mix ） ：包含 40 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L (NH4)2SO4、 20 mmol/L KC1（pH 值为 8.8）、16 mmol/L MgSO4、2.0 mmol/L dNTPs、0.2 % Trion X-100。 5.2 Bst DNA 聚合酶：酶浓度 8 U/μL。 5.3 显色液：SYBR Green I 荧光染料，1 000×。 5.4 引物：根据苹果轮纹病菌 ITS 基因序列设计一套特异性引物，包括外引物 1（F3），外引物 2（B3）， 内引物 1（FIP），内引物 2（BIP），环引物 1（LF）和环引物 2（LB）。外引物扩增片段长度：189 bp， 引物序列见附录 A。 2) 5.5 DNA 快速提取液：DNA-EZ Reagents All-DNA-Fast-Out 。 5.6 甜菜碱：5 mol/L。 5.7 离心管：0.1 mL、1.5 mL。 5.8 塑料研磨棒：长度 70 mm，研磨头外径 6.2 mm，研磨头长度 9.5 mm。 6 仪器设备 6.1 恒温箱：满足 65 ℃±3 ℃、80 ℃±1 ℃要求。 6.2 移液器：量程 0.5 μL～10 μL，量程 10 μL～100 μL，量程 100 μL～1 000 μL。 7 测定步骤 7.1 试验设置 7.1.1 阴性对照：采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌（Valsa mali）基因组 DNA 为模板。 7.1.2 阳性对照：采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）基因组 DNA 为模板，浓度应略高于方法检出限。 7.1.3 空白对照：以水代替 DNA 模板。 7.2 试样采集 进行田间轮纹病菌快速检测时，切取约0.5 cm×0.5 cm待检测的苹果组织（果实、叶片、枝条）， 放置于1.5 mL离心管中保存并标记。 7.3 试样 DNA 提取 7.3.1 将 100 μL DNA 快速提取液加入到盛有试样的 1.5 mL 离心管中，用研磨棒研磨 5 min。 7.3.2 80 ℃±1 ℃加热 5 min，如果是难以破裂的细胞和材料，则保温时间可以延长到 10 min～30 min。 7.3.3 用手振荡混匀后取裂解物直接进行 LAMP 反应。 7.4 LAMP 反应步骤 7.4.1 反应体系 1) 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2) 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 DB37/T 4101—2020 LAMP反应体系见表1。每个试样各做2个平行管。加样时应使试样DNA溶液完全加入反应液中，不要 粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1 μL显色液滴于反应管的管盖内侧，盖管盖时应尽量小心， 防止显色液混合进入反应液中。这样试样扩增反应后不必开盖即可观察颜色变化。 表1 LAMP 反应体系 组分 工作液浓度 加样量 反应体系最终浓度 外引物 1（F3） 10 μmol/L 0.5 μL 0.2 μmol/L 外引物 2（B3） 10 μmol/L 0.5 μL 0.2 μmol/L 内引物 1（FIP） 10 μmol/L 2 μL 0.8 μmol/L 内引物 2（BIP） 10 μmol/L 2 μL 0.8 μmol/L 环引物 1（LF） 10 μmol/L 1 μL 0.4 μmol/L 环引物 2（LB） 10 μmol/L 1 μL 0.4 μmol/L Lamp PCR Master Mix 2× 12.5 μL 1× Bst DNA 聚合酶 8 U/μL 0.5 μL 0.16 U/μL 甜菜碱 5 mol/L 4 μL 0.8 mmol/L DNA 模板 - 1 μL - 水 - 补足至 25.0 μL - 7.4.2 反应过程 65 ℃±3 ℃恒温扩增60 min，80 ℃±1 ℃持续10 min使酶灭活，反应结束。 7.4.3 显色反应 反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在正常光照条件下于黑色背景（如黑布、 黑色纸板）下进行颜色观察。阴性对照：反应管中液体呈橙色。阳性对照：反应管中液体呈绿色。空白 对照：反应管中液体呈橙色。 7.5 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T 27403中附录D规定。 8 结果判定 8.1 待测样品 2 个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结 果为阴性，不携带苹果轮纹病菌。 8.2 待测样品 2 个平行样反应管中液体至少一管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品 检测结果为阳性，携带苹果轮纹病菌。 8.3 若与上述条件不符，则本次检查结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。 3 DB37/T 4101—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 苹果轮纹病菌 ITS 基因特异性序列 A.1 苹果轮纹病菌ITS基因特异性序列（accession no.MN559436.1） 1 ATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGC 61 TCTGCTTGGTATTGGGCACCGTCCTTTGCGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGT 121CTTGCCTCAAGCGTAGTAGAACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCCGCCGG 181 ACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC 注：下划线所示部分为引物扩增匹配区段。 A.2 组成引物中碱基构成 外引物1（F3，5’-3’）：TGCCTGTTCGAGCGTCAT 外引物2（B3，5’-3’）：TCCGAGGTCAACCTTGAGAA F1c F2 内引物1（FIP，5’-3’）：CACCGCCGAGGTCTTTGAGGTACAACCCTCAAGCTCTGCT B1c B2 内引物2（BIP，5’-3’）：GCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTGTTCAGAAGGTTCGTCCGG 环引物1（LF，5’-3’）：GGACGGTGCCCAATACCA 环引物2（LB，5’-3’）：AGAACATACATCTCGCTTCGGAG _________________________________ 4