ICS 65.020.30 CCS B 44 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15/T 2033—2020 乳酸菌胞外多糖的分离纯化 与鉴定技术规程 The technical specification for separation, purification and identification of lactobacillus extracellular polysaccharides 2020-11-30 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-12-30 实施 发 布 DB15/T 2033—2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。 本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、高民、修磊、盛守新、张昊池、潘娜、马燕芬、羿静。 I DB15/T 2033—2020 乳酸菌胞外多糖的分离纯化 与鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了乳酸菌胞外多糖的提取、分离、纯化与鉴定的方法与技术流程。 本文件适用于乳酸菌胞外多糖的提取、分离、纯化及鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 32198 红外光谱定量分析技术通则 GB/T 36240 离子色谱仪 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria(LAB) 一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸、无芽孢、革兰氏染色细菌的总称。 3.2 乳酸菌胞外多糖 lactic acid bacteria exopolysaccharide(LAB EPS） 乳酸菌在生长代谢过程中合成并分泌于细胞外或渗入培养基中的多糖及其混合物。 3.3 硫酸-苯酚法 sulfuric acid-phenol method 利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合 物，再以比色法测定。 3.4 离子交换层析 ion-exchange chromatography(IEC) 在一定pH 条件下，根据被分离样品所带电荷不同而进行的分离方法。可根据样品性质来选择合适 的离子交换介质。 3.5 凝胶层析 gel filtration chromatography 1 DB15/T 2033—2020 按照样品分子量大小进行分离的技术，又称凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。通常使用Superdex、 Surperose、Sephacryl、Sepharose、Sephadex等凝胶纯化介质。 3.6 紫外光谱 ultraviolet and visible spectrum(UV) 测定物质分子在紫外光区吸收光谱的分析方法。一般的紫外光谱是指近紫外区（200 nm～380 nm） 的吸收光谱。 3.7 红外光谱 infrared spectroscopy(IR） 分子能选择性吸收某些波长的红外线，检测红外线被吸收的情况可得到物质的红外吸收光谱，又称 分子振动光谱或振转光谱。通常所说的红外光谱即指中红外光谱（2.5 μm～25 μm）。 3.8 离子色谱 ion chromatography 高效液相色谱(HPLC)的一种，是利用被测物质的离子性分离和检测阴离子和阳离子的一种液相色谱 方法。 4 材料、仪器和试剂 4.1 菌株材料 分离、保存并鉴定的乳酸菌菌株。 4.2 仪器 数显电热水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，超高速低温离心机，真空低温冷冻干燥机，荧光 倒置显微镜，高效液相色谱仪，蛋白核酸纯化系统，离子色谱仪，红外光谱仪，多角度激光检测器。 4.3 试剂与耗材 4.3.1 试剂 MRS固体培养基，MRS液体培养基, 无水乙醇、三氯乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氢氧化钠、葡萄糖、 浓硫酸、浓盐酸、冰醋酸、无水乙酸钠、氯化钠等均为分析纯。 4.3.2 耗材 DEAE Sepharose Fast Flow，Sepharose CL-6B，Column XK26/40、Column XK16/100层析柱，透析 袋（截留量8 K～12 K Da）。 4.3.3 多糖标准品 葡萄糖胺，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖，葡萄糖醛酸。 2 DB15/T 2033—2020 5 测定步骤 5.1 乳酸菌粗多糖的提取 5.1.1 活化培养 MRS固体培养基活化乳酸菌，挑取单菌落至MRS液体培养基中，厌氧条件下，37 ℃培养20 h。按4 % （v/v）接种量接种到适量MRS液体培养基中，厌氧条件下37 ℃培养30 h。将发酵后的菌液5000 rpm、4 ℃ 条件下离心15 min，弃去沉淀，收集上清。 5.1.2 三氯乙酸处理 上清液中缓慢加入浓度为800 mg/mL三氯乙酸，使其终浓度为40 mg/mL，4 ℃静置8 h后10000 rpm、 4 ℃条件下离心10 min，弃去沉淀，收集上清。 5.1.3 无水乙醇处理 按1:4的体积比向上清液中加入无水乙醇，4 ℃过夜，10000 rpm、4 ℃条件下离心10 min后收集底 部沉淀。将沉淀溶于60 ℃蒸馏水中，10000 rpm离心10 min，弃去底部不溶沉淀，收集上清。 5.1.4 透析 将上清液装入截留分子量为8 K Da的透析袋内，透析2 h～4 h后，更换透析液，之后每6 h～8 h 更换一次透析液，连续透析2 d。收集透析袋内多糖溶液，真空冷冻干燥制得乳酸菌粗多糖。 5.2 粗多糖纯化 5.2.1 离子交换纯化 5.2.1.1 层析柱处理 将DEAE-Sepharose Fast Flow填料装填于Column XK 26/40（内径：26 mm，高度400 mm）层析柱中， 体积为150 mL，用Tris-HCl溶液（55 mM，pH 7.5～7.8）以1.5 mL/min流速过夜平衡层析柱。 5.2.1.2 纯化 将粗多糖溶于Tris-HCl中，配成浓度为10 mg/mL溶液，0.22 μ m滤膜过滤后上样。流动相使用 Tris-HCl和含1 M NaCl的Tris-HCl洗脱液，将蛋白质核酸纯化系统的流速设置为2.0 mL/min，每3 min 收集一次洗脱液至试管中。 5.2.1.3 洗脱曲线绘制 用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，在490 nm处检测吸光值，绘制洗脱曲线。 5.2.2 分子筛纯化 5.2.2.1 层析柱处理 3 DB15/T 2033—2020 将Sepharose CL-6B装填于Column XK 16/100（内径：16 mm，高度1000 mm）层析柱中，体积为150 mL，用Tris-HCl溶液（55 mM，pH 7.5～7.8）以0.5 mL/min流速过夜平衡层析柱。 5.2.2.2 纯化 将上一步纯化收集得到的最大组分溶于Tris-HCl中，配成浓度为5 mg/mL溶液，0.22 μ m滤膜过滤 后上样。流动相使用Tris-HCl洗脱液，流速为0.5 mL/min，每10 min收集一次洗脱液至试管中。 5.2.2.3 洗脱曲线绘制 用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，在490 nm处检测吸光值，绘制洗脱曲线。 5.3 EPS 鉴定 5.3.1 紫外光谱扫描 检测纯化后的多糖是否含有核酸和蛋白质这两类杂质。用去离子水将以上获得的纯EPS溶解，浓度 为0.5 mg/mL，用0.22 μ m滤膜过滤后在185 nm～540 nm波长范围内进行紫外扫描。样品流速为0.5 mL/min。流动相为去离子水。 5.3.2 红外光谱分析 检测多糖化合物特有的结构基团。取干燥的1 mg～2 mg EPS和100 mg～200 mg溴化钾粉末混匀后进 行压片，厚度约0.1 mm。红外光谱仪对样品进行红外扫描，按照GB/T 32198执行。 5.4 EPS 分子量测定 5.4.1 色谱条件 色谱柱：TSK Gel G4000PWxl； 流动相：0.1 M NaCl溶液； 流速：0.5 mL/min； 进样量：200 μ L。 5.4.2 分子量的测定 称取EPS样品适量，溶于0.1 M NaCl溶液中，配成浓度为1 mg/mL溶液，按5.4.1所述条件上样。使 用Astra数据分析软件计算样品的分子量。 5.5 EPS 单糖组成测定 5.5.1 色谱条件 色谱柱：分析柱：Carbo PacTMPA20 3×150 mm Analytical； 淋洗液：250 mM NaOH和1 M NaAC； 流速：0.5 mL/min； 4 DB15/T 2033—2020 进样体积：10 μ L； 柱温：35 ℃； 检测器：脉冲安培检测器，金电极。 5.5.2 梯度洗脱条件 A为水，B为250 mM NaOH，C为1 M NaAC； 0 min～20 min：94% A， 6% B，0% C； 20 min～20.1 min：89% A，6% B，5% C； 20.1 min～35 min：74% A，6% B，20% C； 35.1 min～45 min：20% A，80% B； 45.1 min～55 min：94% A，6% B。 5.5.3 单糖组成测定 称取EPS 10 mg于水解瓶中，加入4 M的三氯乙酸4 mL，充N2 1 min排出管内空气，旋紧螺旋盖，于 120 ℃水解2 h，0.22 μ m滤膜过滤后按5.5.1所述条件进样。根据对比保留时间RT确定EPS中的单糖组 成，并符合GB/T 36240的要求。 5