ICS 65.060.25 B 10/14 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4049—2020 种鸡鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技 术规范 Technical criterion for eradication of mycoplasma gallisepticum and mycoplasma synoviae in breeder flock 2020 - 07 - 09 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 08 - 09 实施 发 布 DB37/T 4049—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所、山东省健牧生物药业有限公司、五莲县畜牧兽医 管理服务中心。 本标准主要起草人：徐怀英、秦卓明、黄迪海、徐宁、亓丽红、井庆川、杨金兴、高月花、曹顶国、 宋玲玲、刘涛。 I DB37/T 4049—2020 种鸡鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技术规范 1 范围 本标准规定了种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技术规范。 本标准适用于曾祖代、祖代及非免疫父母代种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体病的净化。本标准不 适用于疫苗免疫鸡场。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 17999.4 SPF 鸡微生物学监测 第4部分：SPF鸡 血清平板凝集试验 NY/T 553 禽支原体PCR检测方法 NY/T 1168 畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T 5030 无公害农产品兽药使用准则 DB34/T 2160 鸡毒支原体感染防治技术 DB63/T 1652 病害动物及病害动物产品无害化处理技术规程 T/CVMA 1 禽白血病净化技术规范 世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 种鸡 breeding chicken 按照动物育种四系配套的原则，将鸡的遗传谱系分为曾祖代、祖代、父母代和商品代，只有曾祖代 的鸡（原种鸡）可以自繁、自养和留种，而其他后代均必须按照四系配套的原则进行育种，且不能留做 和它同级的种。种鸡（祖代和父母代）是经过不断地选种和选育，具有一定的生产、生长和遗传稳定性， 能够提供子代，且按照育种组织制订的标准验收和鉴定并承认的鸡品种。按经济用途分为蛋用型、肉用 型、肉蛋兼用型和观赏型。 3.2 家禽疫病净化 poultry disease eradication 在一个养禽场或指定的养殖区域内，通过持续不断的检测和监测，及时发现和淘汰患病禽群或带菌 禽群，并通过及时淘汰感染禽群的方法，以实现根除某种家禽疾病的过程。 1 DB37/T 4049—2020 4 诊断 4.1 临床诊断 4.1.1 鸡毒支原体病 参照DB34/T 2160的临床症状和病理变化。 4.1.2 滑液囊支原体病 4.1.2.1 流行特点 感染通常见于4周～16周龄的鸡。鸡群的患病率一般为5 %～10 %，病死率不超过10 %。 4.1.2.2 临床症状 引起的呼吸道症状不明显，受侵害部位在关节的滑液囊膜及腱鞘。出现关节肿胀、热痛、胸部龙骨 上水疱、跛行甚至站不起来，从而造成雏鸡或青年鸡生长发育受阻，产蛋鸡生产性能下降，蛋壳质量变 差、易碎。 最初症状是鸡冠苍白、生长迟缓和关节肿胀，跗关节和爪垫是主要感染部位。随着病情的发展，出 现鸡冠萎缩、羽毛粗乱、跛行甚至站立不起。呼吸系统感染滑液囊支原体症状轻微，但感染禽是带菌者。 成年鸡群感染多表现为蛋壳质量变差、易碎。 4.1.2.3 病理变化 病禽主要表现为滑膜炎。在病情较轻时，在肿胀的关节部位可见到有多量黏稠的渗出液。严重时， 可见到腱鞘处有黄白色囊状物，内有白色黏液，关节滑液囊或脚垫内有黏液性呈灰白色的乳酪样渗出物， 有时关节软骨出现糜烂。趾关节和跗关节可见有异嗜性白细胞和纤维素浸润。 4.2 病原分离培养 对可疑鸡群进行支原体病原的分离培养，培养基配制、分离部位及培养条件等参照世界动物卫生组 织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册相关内容进行。 4.3 血清学检测 对种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体凝集抗体的检测，参照GB/T 17999.4进行，在2 min内出现凝 集者为阳性；2 min内不凝集者为阴性；介于上述两者之间为可疑，进行复核试验，如仍为可疑，判为 阳性（见附录B）。 4.4 核酸检测 聚合酶链式反应（PCR）和环介导等温扩增技术（LAMP）方法可任选其一。 4.4.1 试剂 除非另有说明，仅使用分析纯试剂。 4.4.1.1 实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 4.4.1.2 2×Taq PCR MasterMix Ⅱ。 4.4.1.3 10×LAMP Amplification Buffer，-20 ℃保存。 4.4.1.4 10 mmol/L Betaine 溶液：配制见附录 A.1，-20 ℃保存。 2 DB37/T 4049—2020 4.4.1.5 4.4.1.6 4.4.1.7 4.4.1.8 4.4.1.9 4.4.1.10 4.4.1.11 Bst DNA Polymerase（6 U/μL），-20 ℃保存，避免反复冻融。 MgSO4(100 mmol/L) ：配制见附录 A.2，-20 ℃保存。 dNTP 混合液(10 mmol/L)，-20 ℃保存，避免反复冻融。 SYBR Green Ⅰ核酸染料，4 ℃保存。 DNA Marker 2000，-20 ℃保存，避免反复冻融。开盖后于 4 ℃保存不超过 3 个月。 细菌基因组 DNA 提取试剂盒，4 ℃保存。 标准菌株，采用的 MG 标准菌株为 F-36 株，采用的 MS 标准菌株为 GX11-T 株。 4.4.2 仪器设备 4.4.2.1 4.4.2.2 4.4.2.3 4.4.2.4 4.4.2.5 4.4.2.6 4.4.2.7 4.4.2.8 4.4.2.9 PCR 扩增仪。 台式高速冷冻离心机：转速≥12 000 r/min。 微量移液器：2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。 电子天平：精度 0.01 mg。 恒温水浴锅或恒温金属浴。 涡旋仪。 生物安全柜。 电泳仪。 紫外透射反射分析仪。 4.4.3 样品处理 取咽喉棉拭子。将棉拭子样品悬浮于1 mL PBS溶液中，混匀成悬浮液。 4.4.4 DNA 提取 将棉拭子样品制成的混悬液4 000 r/min离心5 min，将离心后的上清置于新的1.5 mL离心管中，在 4 ℃条件下，12 000 g离心20 min，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮在25 μL～50 μL的0.1 %焦碳 酸二乙酯(DEP)水中。按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取DNA。 4.4.5 聚合酶链式反应（PCR）方法 鸡毒支原体和滑液囊支原体的PCR检测方法使用的引物及反应条件等参考NY/T 553。 4.4.6 环介导等温扩增技术（LAMP）方法 4.4.6.1 引物 依据鸡毒支原体（MG）的mgc2基因序列和滑液囊支原体（MS）的16S rRNA序列，分别设计LAMP引物， 扩增长度约200 bp。 MG-F3：5’-ACACTTGTTTTACATGAAGGT-3’ MG-B3：5’- CAACCATCTTTTGGTGTTCT-3’ MG-FIP：5’-ACAATCAACCCAGCACCTGCGTTGGTCCAAGAAAGATTACCT-3’ MG-BIP：5’- TGTTTCTTTACTCTTGGGTTTAGGGTCACGTTCTTGGATCATCA-3’ MS-F3：5’- GCATTAAGCGGATCGGTT -3’ MS-B3：5’- AACTGCTGCATCAAGAGC -3’ MS-FIP：5’- TGTTGCTGCTGTGTATTTTTCTTCTGCAGTTAAAGATGATGCACAA-3’ MS-BIP：5’- ACTAGAAGATGGAACAAAACTTGCAGCAGATTCTAGATCACTTTGAGT-3’ 3 DB37/T 4049—2020 4.4.6.2 LAMP 反应条件 所采用的试剂盒反应体系见表1。 表1 禽支原体 LAMP 反应体系 反应组分 体积 10×Amplification buffer Ⅱ 2.5 μL dNTP 混合液(10 mmol/L) 4.0 μL F3/B3(10 μmol/L) 0.5 μL×2 FIP/BIP(30 μmol/L) 1 μL×2 Betaine(10 mmol/L) 2 μL DNA 1 μL BstDNAPolymerase(6 U/μL) 1 μL MgSO4(100 mmol/L) 1 μL ddH20 10.5 μL 取DNA模板1-5 μL置于分别加入鸡毒支原体/鸡滑液囊支原体LAMP引物已配置好的上述试剂盒体系 内，在管盖内壁加1 mL 1 000×SYBR GreenⅠ，通过染料液滴本身的液体表面张力使得染料附着在管盖 上，从而避免染料在反应过程中接触反应液抑制反应，关闭管盖时需注意避免用力过大防止染料滴入反 应液。置于63 ℃水浴锅中，反应60 min，80 ℃作用10 min终止反应。 4.4.6.3 结果判定 瞬时离心LAMP反应管，使管盖内侧壁的SYBR Green Ⅰ核酸染料与LAMP反应体系充分混匀。在自然 光照下，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色，阳性反应管内液体变为黄色。反应管置于紫外透射反 射分析仪下，阴性反应管不显现荧光，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光（见附录C）。 5 净化检测规程 5.1 曾祖代和祖代鸡 5.1.1 出壳雏鸡的检测与处置 5.1.1.1 雏鸡饲养管理 参照T/CVMA 1的方法，将种蛋隔离孵化，出壳后小批量隔离饲养，减少孵出的雏鸡相互之间的感染 机会。 5.1.1.2 样品的收集 采集出壳后的雏鸡咽喉棉拭子，置于预先做好标记的1.5 mL灭菌离心管，离心管中预先加入0.5 mL 样品稀释液，充分震荡摇均。每次对一只鸡采样后，应注意更换一次性手套或对双手进行消毒，方可进 行另一只鸡采样，避免产生交叉的污染。 5.1.1.3 核酸检测和病原鉴定 将采集到的样品一分为二。一部分样品用于进行PCR或LAMP检测（二选其一）。PCR按照NY/T 553