ICS 65.020.01 B 15 贵 DB52 州 省 地 方 标 准 DB52/T 1501.16—2020 农作物抗病性鉴定技术规范 第 16 部分:白菜抗芜菁花叶病毒病 Technical specification for evaluation of crop resistance to diseases Part 16：Chinese cabbage resistance to Turnip Mosaic Virus 2020 - 05 - 22 发布 贵州省市场监督管理局 2020 - 09 - 01 实施 发 布 DB52/T 1501.16—2020 目 次 前 言 .............................................................................. II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 鉴定方法 .......................................................................... 2 5 抗病性评价 ........................................................................ 3 附录 A（资料性附录） 芜菁花叶病毒病原、症状及发生流行规律 ............................ 4 附录 B（资料性附录） 芜菁花叶病毒病原鉴定及保存方法 .................................. 5 附录 C（资料性附录） 白菜芜菁花叶病毒病抗病性鉴定记载、评价表 ........................ 8 I DB52/T 1501.16—2020 前 言 《农作物抗病性鉴定技术规范》分为17个部分： ——第1部分：水稻抗稻瘟病； ——第2部分：水稻抗稻曲病； ——第3部分：水稻抗纹枯病； ——第4部分：小麦抗条锈病； ——第5部分：小麦抗白粉病； ——第6部分：小麦抗纹枯病； ——第7部分：马铃薯抗晚疫病； ——第8部分：玉米抗丝黑穗病； ——第9部分：玉米抗大斑病； ——第10部分：玉米抗小斑病； ——第11部分：玉米抗灰斑病； ——第12部分：玉米抗南方锈病； ——第13部分：辣椒抗枯萎病； ——第14部分：辣椒抗炭疽病； ——第15部分：白菜抗根肿病； ——第16部分：白菜抗芜菁花叶病毒病； ——第17部分：大豆抗大豆花叶病毒病。 本部分为《农作物抗病性鉴定技术规范》的第16部分。 本部分按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本部分由贵州省植物保护研究所提出。 本部分由贵州省植物保护标准化技术委员会（GZ/TC16）归口。 本部分起草单位：贵州省植物保护研究所 长顺县果蔬站 榕江县植保植检站 黔东南州植保植检站 黎平县植保植检站。 本部分主要起草人：王莉爽、刘茜、范刚强、江滋琼、李淳、陈小均、刘学辉、刘荣平、毛世虎。 II DB52/T 1501.16—2020 农作物抗病性鉴定技术规范 第 16 部分：白菜抗芜菁花叶病毒病 1 范围 本标准规定了白菜抗芜菁花叶病毒病（Turnip Mosaic Virus，TuMV）鉴定方法与抗病性评价。 本标准适用于贵州区域种植的白菜品种(系) 、种质资源对芜菁花叶病毒抗病性的鉴定和评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T 2060.4 辣椒抗病性鉴定技术规程 第 4 部分：辣椒抗黄瓜花叶病毒病鉴定技术规程 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1 芜菁花叶病毒 Turnip Mosaic Virus，TuMV 芜菁花叶病毒是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的重要成员之一，是一种在全世界广泛存在的植物病 毒，主要危害十字花科植物（病原、田间症状和发生规律见附录A）。 3.2 抗病性 disease resistance 植物体所具有的能够减轻或克服病原物致病作用的可遗传的性状。 3.3 人工接种 artificial inoculation 在适宜条件下，通过人为接种的方式将人工培养或收集的病原物置于植物适当部位并使之发病的过 程。 3.4 感病对照 susceptible control variety 用于衡量病害发生程度的感病品种。本标准选用当地主栽白菜和美五号为感病对照。 3.5 抗病性评价 evaluation of disease resistance 根据抗病性分级标准判别白菜对芜菁花叶病毒病的反应程度和抵抗水平。 1 DB52/T 1501.16—2020 4 鉴定方法 4.1 接种体的准备 将准确鉴定的芜菁花叶病毒（TuMV）储藏于-80 ℃冰箱备用（接种体的鉴定及保存方法见附录B）。 4.2 材料培养 白菜种子直播于营养钵中，每钵直播1～2 粒种，育苗土为专用育苗基质，设置3 个重复，每个重 复20 株。人工气候室温度设置为白天25 ℃，夜间20 ℃；光照设置为每天12 h。定期浇水和防治蚜虫。 4.3 接种 4.3.1 接种时期 苗期鉴定在白菜2叶1心时接种。 4.3.2 接种方法 采用人工摩擦接种法，参考NY/T 2060.4并做修改。接种前，称取一定质量的新鲜病叶放入高温灭 菌过的研钵中，加入5 倍体积的磷酸缓冲液（0.05 mol/L，PH=7.2）研磨匀浆，两层纱布过滤，立即用 于接种。接种时：先在植株的2片真叶的正面洒少许600目金钢砂，然后用手指蘸取病毒汁液在叶面上来 回摩擦2～4 次，摩擦后用双蒸水立即冲洗叶面；接种后，黑暗24 h再恢复光照。 4.3.3 接种后的植株管理 接种完成后，植株正常管理。 4.4 调查 4.4.1 调查时间 待鉴定材料长至6叶期（一般接种后21 d～30 d）进行抗病性调查。 4.4.2 调查和计算方法 共调查2次，接种后21 d调查1次病毒病发病情况， 28 d调查第2 次。用公式1计算病情指数，根据 2次的病情指数结果进行校正，以消除待鉴定材料因生育期不同而导致抗性程度的差异。 病情指数（DI） 4.4.3 （各级病株数  相应级数值）100 .................. (1) 调查总株数  9 病情分级 白菜品种抗芜菁花叶病毒病病情分级见表1。 2 DB52/T 1501.16—2020 表1 白菜芜菁花叶病毒病病情分级 病情级别 病情描述 0 植株正常生长，无任何症状。 1 接种叶和心叶初现症状。 3 感病叶片数占全株叶片数 1/3 以下。 5 感病叶片数占全株叶片数的 1/3～1/2。 7 感病叶片数占全株叶片数 1/2 以上。 9 多数叶片重花叶，皱缩，畸形或有坏死斑，植株严重矮化，甚至死亡。 5 抗病性评价 根据抗病性鉴定结果对鉴定材料进行抗病性评价，抗性以记载的平均病情级别为准，当感病品种病 情指数达50时，视为该批次鉴定有效。抗病性评价分级见表2。芜菁花叶病毒病抗病性鉴定的田间调查 记录表和抗病性评价表见附录C。 表2 芜菁花叶病毒病抗病性评价分级 抗病性级别 平均病情指数（DI） 抗病性评价 0 DI=0 免疫（I） 1 0.1＜DI≤15 抗病（R） 3 15.1＜DI≤30 中抗（MR） 5 30.1＜DI≤45 中感（MS） 7 45.1＜DI≤60 感病（S） 9 DI≥60.1 高感（HS） A 3 DB52/T 1501.16—2020 BA 附 录 A （资料性附录） 芜菁花叶病毒病原、症状及发生流行规律 A.1 病原 TuMV属于马铃薯Y病毒属的病毒，长约650 nm～900 nm，直径11 nm～15 nm的外壳蛋白包被着的 杆状粒子。杆状类型为弯曲杆螺距3.4 nm～3.5 nm（图A.1）。 图A.1 A.2 马铃薯 Y 病毒属病毒粒子图（756nm×13nm） 症状 TuMV侵染白菜后初期表现黄化、花叶、深绿浅绿相间以及沿叶脉褪绿等症状，后期出现畸形、矮 化、整株畸形、生育期推迟甚至死亡等（图A.2）。 图A.2 TuMV 危害白菜田间症状图 A.3 发生流行规律 TuMV主要通过蚜虫以非持久性的方式传播，也通过种子和受感染的活植物材料传播。 4 DB52/T 1501.16—2020 CB 附 录 B （资料性附录） 芜菁花叶病毒病原鉴定及保存方法 B.1 B.1.1 TuMV的分子鉴定 植物总RNA的提取 选取病毒病症状明显的样品，使用植物总RNA小提试剂盒进行植物总RNA提取。实验过程要勤换手套， 戴好口罩，使用RNase-free的枪头，离心管、试剂和水: a) 取 1 ml 裂解液，转入 1.5 ml 离心管中，备用； b) 液氮中研磨适量白菜叶片成细粉后，取 60 mg～100mg 细粉转入上述装有裂解液的离心管, 立 即用手剧烈振荡 20 s 充分裂解； c) 将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育 5 min 以使核蛋白体完全分解； d) 每 1ml 裂解液加 0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡 15 s 并将其在室温下孵育 3 min； e) 于 4 ℃12,000 rpm 离心 10 min，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相， RNA 存在于水相中。水相层的容量大约为所加裂解液体积的 50%，把水相转移到新管中，进行 下一步操作； f) 加入水相 0.5 倍体积的无水乙醇，混匀，转入吸附柱 RA 中； g) 12,000 rpm 离心 1 min，弃废液，将吸附柱重新套回收集管； h) 加 500 μL 去蛋白液，12,000 rpm 离心 1 min，弃掉废液； i) 加入