ICS 11.120.20 C 30 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5127.16—2019 植入性医疗器械 高分子材料 浸提液中有 毒有害物质的测定 第 16 部分：生物负载 薄膜过滤法 2019 - 12 - 27 发布 河北省市场监督管理局 2020 - 01 - 28 实施 发 布 DB13/T 5127.16—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 DB13/T 5127《植入性医疗器械 高分子材料 浸提液中有毒有害物质的测定》共分16个部分： ——第1部分：柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钾迁移量 原子吸收分光光度法； ——第2部分：二巯基丙醇迁移量碘量法； ——第3部分：葡萄糖迁移量 碘量法； ——第4部分：柠檬酸迁移量 酸碱中和滴定法； ——第5部分：硫氰酸胍迁移量 分光光度法； ——第6部分：丙酮迁移量 气相色谱法； ——第7部分：丙交酯迁移量 气相色谱法； ——第8部分：对苯二甲酸迁移量 高效液相色谱法； ——第9部分：乙醇迁移量 气相色谱法； ——第10部分：环氧乙烷迁移量 气相色谱法； ——第11部分：戊二醛迁移量 高效液相色谱法； ——第12部分：异氰酸酯迁移量 高效液相色谱法； ——第13部分：甲醛迁移量 气相色谱质谱联用法； ——第14部分：蛋白质迁移量可见-紫外分光光度法； ——第15部分：铅、砷、镉、铬、铜、锑、钡、铝、锌、锡迁移量 电感耦合等离子体质谱法； ——第16部分：生物负载 薄膜过滤法。 本部分为DB13/T 5127的第16部分。 本部分由河北省药品监督管理局提出并归口。 本部分起草单位：河北省医疗器械与药品包装材料检验研究院。 本部分主要起草人：康莉、刁立琴、付钊、高保栓、冯毅。 I DB13/T 5127.16—2019 植入性医疗器械 高分子材料 浸提液中有毒有害物质的测定 第 16 部分：生物负载 薄膜过滤法 1 范围 本标准规定了植入性医疗器械高分子材料浸提液中生物负载的测定方法。 本标准适用于植入性医疗器械高分子材料浸提液中生物负载的测定和验证。 本标准适用于具有一定生物负载水平的植入性医疗器械。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 19973.1 医疗器械的灭菌微生物学方法 第 1 部分：产品上微生物总数的测定 3 方法原理 选择适宜的洗脱方法对试样上自然污染的微生物进行洗脱处理，将洗脱液进行薄膜过滤，并对滤 膜进行培养计数，得到试样上洗脱的微生物总数。再用重复回收法确定试样的修正系数。最后，通过 修正系数对试样上洗脱的微生物总数进行修正，从而确定试样上的生物负载水平。 4 试剂与材料 4.1 胰酪大豆胨琼脂培养基。 4.2 沙氏葡萄糖琼脂培养基。 4.3 0.9 %氯化钠注射液。 5 仪器与设备 5.1 压力蒸汽灭菌器。 5.2 洁净工作台。 5.3 生化培养箱。 5.4 电子天平 5.5 拍击式无菌均质器。 5.6 恒温振荡器。 5.7 过滤装置。 1 DB13/T 5127.16—2019 5.8 0.45μ m 无菌微孔滤膜。 6 试验步骤 6.1 微生物采集 6.1.1 袋蠕动法 该洗脱方法尤其适用于软质、纤维和/或吸附性材料，但可能不适用于能刺破袋的任何材质（如带 针或含有坚硬部分的器械）。 将试样和已知体积的洗脱液装在一无菌均质袋中，设定均质器的洗脱参数，推荐将洗脱参数设定 为拍击频率6次/秒，运行时间60 s，启动均质器，使洗脱液贯穿试样内外。 6.1.2 机械振摇法 该洗脱方法为通用方法，适用于大多数材料和样品。 将试样和已知体积的洗脱液装在一无菌容器中，设定振荡器的洗脱参数，推荐将洗脱参数设定为 振摇频率200 r/min，运行时间60 s，开启振荡器进行振摇洗脱。 6.2 菌落总数测定 6.2.1 试样制备 在无菌环境下，打开至少5个包装，从每个包装中取样，准确量取3份样品，每份10 g±1 g或100 2 cm ±10 cm （以内外总表面积计），分别为样1、样2、样3。 2 6.2.2 试样洗脱 将3份试样分别放入3个无菌均质袋/或无菌容器中，向每个无菌均质袋/或无菌容器中加入100 mL 洗脱液，按设定好的参数对试样分别进行洗脱。 6.2.3 移至培养基 对洗脱液进行薄膜过滤。将每份试样的洗脱液分别通过薄膜过滤等量完全过滤到两张滤膜上，每 张滤膜再用100 mL0.9 %氯化钠注射液进行冲洗。将滤膜菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板 和沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。 6.2.4 培养计数 将3个胰酪大豆胨琼脂培养基平板置30℃～35℃生化培养箱中培养3 d～5 d，将3个沙氏葡萄糖琼 脂培养基平板置20℃～25℃生化培养箱中培养5 d～7 d。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。 6.2.5 结果计算 每个试样洗脱的菌落总数按公式（1）计算。 Xi=2（Ai+Bi）……………………………………………………（1） 式中： Xi--第i个试样洗脱的菌落总数，CFU； Ai--第i个试样胰酪大豆胨琼脂培养基平板菌落数，CFU； Bi--第i个试样沙氏葡萄糖琼脂培养基平板菌落数，CFU； 2 DB13/T 5127.16—2019 i=1,2,3。 3个试样洗脱的平均菌落数按公式（2）计算。 X= （X1+X2+X3）……………………………………………………（2） 式中： X--3个试样洗脱的平均菌落数，CFU。 6.3 修正系数测定 6.3.1 试样制备 在无菌环境下，打开至少5个包装，从每个包装中取样，准确量取3份样品，每份10 g±1 g或100 2 cm ±10 cm （以内外总表面积计），分别为样a、样b、样c。 2 6.3.2 试样洗脱 在无菌环境下，将3份试样分别放入3个无菌均质袋/或无菌容器中，向每个无菌均质袋/或无菌容 器中加入100 mL洗脱液，按设定好的参数对试样分别进行重复洗脱。每重复一次后，将洗脱液全部回 收。 6.3.3 移至培养基 对洗脱液进行薄膜过滤。将每份试样的每一次洗脱液分别通过薄膜过滤等量完全过滤到两张滤膜 上，每张滤膜再用100 mL0.9 %氯化钠注射液进行冲洗。将滤膜菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养 基平板和沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。 用熔化的回收培养基涂在试样表面上，让培养基变硬，然后使试样在规定的培养条件下进行培养。 6.3.4 培养计数 将贴有滤膜的胰酪大豆胨琼脂培养基平板及涂有胰酪大豆胨琼脂培养基的试样置30℃～35℃生化 培养箱中培养3 d～5 d，将贴有滤膜的沙氏葡萄糖琼脂培养基平板及涂有沙氏葡萄糖琼脂培养基的试 样置20℃～25℃生化培养箱中培养5 d～7 d。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。 6.3.5 结果计算 表1中列出了重复处理过程中经过5次重复洗脱后的一组理想化数据。 表1 某产品重复洗脱后测得的菌落数 洗脱次数 产品 琼脂覆盖 总菌落数 na5 ma Na=na1+na2+na3+na4+na5+ma nb4 nb5 mb Nb=nb1+nb2+nb3+nb4+nb5+mb nc4 nc5 mc Nc=nc1+nc2+nc3+nc4+nc5+mc 1 2 3 4 5 样a na1 na2 na3 na4 样b nb1 nb2 nb3 样c nc1 nc2 nc3 3 DB13/T 5127.16—2019 根据表1的数据计算回收率，见表2。 表2 回收率 产品回收总菌落数 第 1 次洗脱 第 1 次洗脱的回收率 样a Na na1 Qa= na1×100%/Na 样b Nb nb1 Qb= nb1×100%/Nb 样c Nc nc1 Qc= nc1×100%/Nc 第 1 次洗脱的平均回收率 Q=（Qa+Qb+Qc）/3 计算中已包括了琼脂覆盖得到的菌落数。某些医疗器械可能会无法应用琼脂覆盖。 采用首次洗脱后的平均回收率Q，修正系数按公式（3）计算。 P=1/Q ……………………………………………（3） 式中： Q --平均回收率； P --修正系数。 6.4 生物负载的计算 生物负载按公式（4）计算。 Y= ……………………………………………………（4） 式中： 2 2 Y --每1g/10cm 试样上的生物负载，CFU/g或CFU/10 cm ； P --修正系数； X --3个试样洗脱的平均菌落数；CFU。 6.5 方法说明 6.5.1 在某一产品的常规检验中，在试验方法没有改变的前提下，可以依据已得到的修正系数进行计 算。 6.5.2 试验方法中的洗脱参数可根据产品特性进行调整。 6.5.3 准确的重复次数取决于若干因素，包括产品特性、构成生物负载的微生物和初始污染水平。预 实验可用于确定重复的次数。 _________________________________ 4