ICS 65.020 B 16 DB 37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3893—2020 芋头病毒检测技术规程 Detection and identification of taro viruses 2020 - 03 - 31 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 05 - 01 实施 发 布 DB 37/T 3893—2020 前 言 本标准由山东省农业农村厅提出。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。 I DB 37/T 3893—2020 芋头病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）的RT-PCR的检测方法。 本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 检测对象 3.1 芋花叶病毒 中文名：芋花叶病毒 学名：Dasheen mosaic virus 缩写：DsMV 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus） 病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子呈线状，长度约为750 nm。一般通过蚜虫传播，还可通过机 械摩擦传播。感染DsMV的芋头植株通常表现为叶片花叶、斑驳、皱缩卷曲、叶脉黄化和茎坏死等症状。 3.2 黄瓜花叶病毒。 中文名：黄瓜花叶病毒 学名：Cucumber mosaic virus 缩写：CMV 分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus） 病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子为球状，直径28 nm～30 nm。主要由蚜虫以非持久性方式 传播。导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。 4 主要仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备和用具 仪器设备和用具主要有： a) PCR 仪； b) 电泳仪； c) 水平电泳槽； 1 DB 37/T 3893—2020 d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) n) o) p) 凝胶成像仪； 高速冷冻台式离心机； 纯水仪； 万分之一天平； 普通冰箱（0℃～4℃）； -20℃低温冰箱； -70℃低温冰箱； 磁力搅拌器； 高压灭菌锅； 可调微量移液器（10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL、5000 μL）； RNase-free 吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）； RNase-free 离心管（1.5 mL、2.0 mL）； RNase-free PCR 反应管。 4.2 试剂 所有实验用试剂均为分析纯；相关试剂配制方法详见附录A；除特殊说明外，均为符合GB/T 6682， 实验用水为无菌超纯水或去离子水。 4.2.1 RNA 提取试剂： a) b) c) d) e) 多糖多酚植物 RNA 提取试剂盒或其他等效产品； 三氯甲烷； 异丙醇； 75%乙醇； RNase-free 超纯水。 4.2.2 反转录试剂： a) b) c) d) e) 随机引物； RNase 抑制剂； 逆转录酶：AMV 或其他等效酶； dNTPs（10 mM）； -20°C 贮藏。 4.2.3 PCR 试剂： a) b) c) d) e) DNA 聚合酶试剂盒：2×Es Taq MasterMix 或其他等效产品； DNA 分子量标记物：100 bp～2000 bp；50×TAE 缓冲液； 核酸染料：Gelred（10000×）溶液或其他等效溶液； 含 10-4 倍浓度 Gelred 的 1%琼脂糖凝胶； 6×DNA 上样缓冲液。 5 RT-PCR 检测方法 5.1 方法提要 2 DB 37/T 3893—2020 芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒皆为RNA病毒，利用TransZol Plant多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行 RNA纯化，然后进行RT-PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。 5.2 样品采集 观察芋头叶片是否出现叶脉褪绿、脉间褪绿黄化、叶片皱缩、花叶、叶片畸形等典型病毒病症状， 取出现上述症状的样品装至无菌样品袋中，标记样品编号、取样时间、取样地点，于低温条件下（2℃～ 8℃）运送至实验室，放置-70℃超低温冰箱保存备用。样品避免反复冻融。以通过分子检测不含病毒的 样品作为阴性对照，以确定感染DsMV或CMV的样品为阳性对照。以下操作对阴性对照、阳性对照进行 同样处理。 5.3 RNA 的提取和纯化 5.3.1 称取 100 mg 样品置 2 ml 离心管中， 用液氮速冻后迅速研磨，然后加入 1 mL 裂解缓冲溶液 （1 mL /100 mg 样品），剧烈振荡混匀，室温放置 5 min；4℃，13000 rpm 离心 5 min。 5.3.2 取上清液于 1.5 mL 离心管中，加等体积的缓冲液 2，颠倒混匀后加入 1/4 体积三氯甲烷，再次 颠倒混匀，室温静置 2 min～3 min。4℃，13000 rpm 离心 10 min。 5.3.3 将上层水相转入新的 1.5 mL 离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 10 min。4℃， 13000 rpm 离心 10 min。 5.3.4 弃上清液，加入 1 mL 预冷的 75％乙醇，洗涤沉淀。4℃，13000 rpm 离心 5 min。 5.3.5 重复上述步骤一次，彻底洗净残留盐分。 5.3.6 弃上清液，室温晾干，加适量 RNase-free H2O 溶解。用紫外分光光度计测定 RNA 浓度。放置-80℃ 备用。 5.4 引物合成 依据文献报道引物序列进行合成（DsMV：Reyes et al.，2009；CMV：姚明华等，2009）。引物配 制成10 μmol/L储存液备用。 表1 RT-PCR 检测的引物序列 检测病毒 引物序列 扩增片段大小/bp DsMV 正义引物：5’-AGGTTGTATTGCAGGCAGATG-3’ 反义引物：5’-GCCAATAACTGTGGCCTGTT-3’ 1034 CMV 正义引物：5’-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3’ 反义引物：5’-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-3’ 777 5.5 检测 5.5.1 反转录合成 cDNA 第一链 取纯化的RNA合成cDNA第一链，反应体系为25 μL，各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总 体积进行适当调整，反应体系成分见表2。将上述试剂依次加入RNase-free离心管中，混匀后，放置于 42℃恒温水浴中1 h后，转入72℃恒温水浴5 min，用于RT-PCR扩增或置-20℃以下冰箱备用。 3 DB 37/T 3893—2020 表2 反应体系成分表 成分 用量 RNA 1.0 μg dNTP（10 mM each） 5.0 μL 随机引物 （10 μmol/L） 2.0 μL 5×Reverse Transcriptase Buffer 5.0 μL RNase 抑制剂 1.0 μL AMV 逆转录酶（10 U） 1.0 μL RNase-free H2O 补足 25.0 μL 5.5.2 PCR 反应 5.5.2.1 反应体系 取合成的cDNA第一链进行RT-PCR反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总 体积进行适当调整。以水代替模板作为空白对照。反应体系成分见表3。 表3 反应体系成分表 成分 用量 2×Es Taq MasterMix 25.0 μL 正义引物（10μmol/L） 2.0 μL 反义引物（10μmol/L） 2.0 μL cDNA 2.0 μL RNase-free H2O 补足 50.0 μL 5.5.2.2 反应程序 将上述反应成分混合好后，放置PCR仪进行反应，反应程序参数见表4。 表4 反应程序参数 步骤 温度 时间 预变性 94℃ 2 min 变性 94℃ 30 s 退火 56℃ 30 s 延伸 72℃ 1 min 终延伸 72℃ 35个循环 5 min 5.5.3 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测 将50×TAE电泳缓冲液稀释成1×TAE电泳缓冲液，制备1%的琼脂糖凝胶。取上述PCR产物10 μL， 加入上样缓冲液（终浓度为1×），混匀后移入胶孔，并在样品孔一侧加入DNA分子量标记。电压大小 根据电泳槽长度确定，一般控制在3 V/cm～5 V/cm，当溴酚蓝指示带移动到凝胶2/3处时关闭电源。电 泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性条带，拍摄并记录。 4 DB 37/T 3893—2020 6 结果判定及表述 6.1 结果判定 6.1.1 阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带（芋花叶病毒：1034 bp； 黄瓜花叶病毒：777 bp），待测样品未出现预期大小的扩增条带，则可判断样品为阴性。 6.1.2 阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照及待测样品出现与所测病毒预期大小的扩增条带（芋 花叶病毒：1034 bp；黄瓜花叶病毒：777 bp），则判定样品检测结果为阳性。 6.1.3 阴性对照或空白对照出现条带，阳性对照未出现预期大小扩增条带，出现以上情况之一，则不 予判定，重新鉴定。 6.2 结果表述 检出结果表述如下： a) 待测样品中检出芋花叶病毒或未检出芋花叶病毒； b) 待测样品中检出黄瓜花叶病毒或未检出黄瓜花叶病毒。 _________________________________ 5