ICS 65.020.99 B 16 DB44 广 东 省 地 方 标 准 DB44/T 2220—2019 柑橘黄龙病菌数字 PCR 检测 Digital PCR for the molecular detection of Citrus Huanglongbing 2019 - 12 - 26 发布 广东省市场监督管理局 2020 - 03 - 26 实施 发 布 DB44/T 2220—2019 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由广东省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：广东省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：程保平、彭埃天、宋晓兵、崔一平、凌金锋、陈霞。 I DB44/T 2220—2019 柑橘黄龙病菌数字 PCR 检测 1 范围 本标准规定了柑橘黄龙病菌亚洲韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）数字PCR检测 的样品采集制备、检测操作方法及结果判定标准。 本标准适用于柑橘出圃苗木和接穗等繁殖材料的检验、田间柑橘黄龙病染病植株的快速检测以及虫 媒亚洲柑橘木虱Diaphorina citri内柑橘黄龙病菌亚洲韧皮部杆菌的检测鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 5040 柑橘苗木产地检疫规程 GB/T 9659 柑橘嫁接苗分级及检验 GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 28062 柑橘黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 柑橘黄龙病的症状 symptoms of Citrus Huanglongbing 该病的典型发病症状为：病株叶片斑驳黄化或均一黄化、嫩梢或枝梢黄化、果实畸形味涩，严重时 引起植株死亡。 3.2 柑橘黄龙病菌 pathogen of Citrus Huanglongbing 柑橘黄龙病的病原是一种韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)的革兰氏阴性细菌，已发现有 亚洲韧皮部杆菌 Candidatus Liberibacter asiaticus、非洲韧皮部杆菌 Candidatus Liberibacter africanus和美洲韧皮部杆菌Candidatus Liberibacter americanus 3个种。目前在我国传播的主要是 亚洲韧皮部杆菌。本标准规定了亚洲韧皮部杆菌的检测方法，对非洲和美洲韧皮部杆菌的检测方法可参 见附录A。 3.3 柑橘红鼻子果 colour infected fruit 柑橘黄龙病病树上不能正常转色的病果。常在果蒂部转红色，果脐部仍为绿色。果实畸形变小、味 涩、质硬，常有发育不全的种子。 1 DB44/T 2220—2019 3.4 亚洲韧皮部杆菌重组质粒 recombinant plasmid of Candidatus Liberibacter asiaticus 以亚洲韧皮部杆菌的16S rDNA为靶标，利用特异引物OI1/OI2c (Jagoueix el al., 1994)扩增获得 的亚洲韧皮部杆菌特异DNA扩增产物，经构建重组质粒、转入大肠杆菌DH5α菌株中繁殖扩增后，重新提 取获得的重组质粒DNA作为亚洲韧皮部杆菌数字PCR检测的阳性对照。 4 实验室设置 参照GB/T 19495.2设置实验室。 5 主要仪器设备和主要试剂 参照GB/T 19495.2。 6 取样及样品处理 6.1 取样用具处理 取样工具应经过121℃、20 min高压蒸汽灭菌。田间采集每个样品后，取样工具应做消毒处理，以 避免样品间交叉污染。 6.2 取样方法 6.2.1 成年树样品取样法 疑似病树直接取枝条中下部有病症的成熟叶片20片；如果树体没有疑似症状，则按照树冠东南西北 四个方位采集样品，每个方位随机采集枝条中下部成熟叶片各5片，每棵树采集叶片20片。 疑似病果/红鼻子果从四个方位各取直径为1 cm的圆形果皮，每个病果采集4块果皮；无症状的果实 以相同的方法采集果皮。 6.2.2 种苗取样法 根据GB 5040，按照柑橘种苗出圃的抽检方法和数量进行取样。 6.2.3 传病媒介亚洲柑橘木虱采样方法 传病媒介亚洲柑橘木虱采样参照GB/T 28062和GB/T 9659进行。 6.3 样品的存储与处理 6.3.1 样品信息的记录 详细记录样品采集信息(见附录B)。 6.3.2 样品的保存 采集到的样品保存于4℃条件，于2 d内寄送有资质的实验室检测。样品在实验室中可置于4℃保存7 d，标准样品和需要长期保存的特殊样品应置于-80℃保存1 y。 2 DB44/T 2220—2019 6.3.3 废弃样品的处理 废弃的样品应经过121℃、15 min高压蒸汽灭菌，达到无害化处理。 6.3.4 样品 DNA 的制备 样品DNA制备应该在检测实验室的样品制备区进行。样品DNA提取可使用商业化DNA提取试剂盒或自 行配制的CTAB灭菌溶液。具体步骤参照GB/T 19495.2进行。 6.3.5 样品 DNA 的保存 制备好的DNA样品在4℃保存1 d～10 d。需要长期保存的DNA样品应置于-80℃保存1 y～2 y。样品 的DNA应做到起始浓度一致，且浓度不可超过数字PCR仪器所规定的检测范围。 7 数字 PCR 反应 7.1 样品与对照的设置 7.1.1 实验重复的设置 每个样品和对照进行数字PCR检测时，均需设置3个重复。 7.1.2 对照的设置 阳性对照为确诊感染亚洲韧皮部杆菌且靶标拷贝数已知的病样DNA，或者包含亚洲韧皮部杆菌16S rDNA靶标基因片段且靶标拷贝数已知的亚洲韧皮部杆菌重组质粒（重组质粒作为模板时应使用限制性 内切酶进行酶切以消除复杂结构）。 阴性对照为确诊没有感染柑橘黄龙病菌的健康柑橘样品的DNA。 空白对照的模板为灭菌的超纯水。 7.2 数字 PCR 反应体系与程序 7.2.1 数字 PCR 反应体系配置 2×Digital PCR Mix(仪器相应配套规定的试剂)8.0 μL，10 μM的探针HLB-P 0.4 μL，10 μM的引物 HLB-F、HLB-R各0.8 μL，测试样品DNA模板3 μL，其余用ddH2O补足至16 μL。 数字PCR反应的有效分割体系数不得低于理论分割体系数的60%。 7.2.2 亚洲韧皮部杆菌的特异引物及探针选用 亚洲韧皮部杆菌的特异引物及探针的引物选用有如下两种方式，可二选一： a) 方式一： 1) 上游引物 HLB-F：5'-GGCTCAACCTTGGAACTGC-3'； 2) 下游引物 HLB-R：5'-TTGCTCCCCACGCTTTC-3'； 3) 探针 HLB-P：FAM 5'-TTGTCTAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGG-3' BHQ。 b) 方式二(Li et al., 2006)： 1) 上游引物 HLB-F：5'-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3'； 2) 下游引物 HLB-R：5'-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3'； 3) 探针 HLB-P：FAM 5'-AGACGGGTGAGTAACGCG-3' BHQ。 3 DB44/T 2220—2019 上述探针5'端荧光报告基团均应为FAM，3'端淬灭基团均应为BHQ；其检测靶标均应为亚洲韧皮部杆 菌的16S rDNA。 7.2.3 数字 PCR 的扩增程序 96℃预变性10 min；98℃变性30 s；60℃延伸2 min；共进行40个循环；最后10℃停止反应。 8 结果判定 8.1 阈值的设定 根据数字PCR结果中扩增反应的基线或者体系中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阈值限。 8.2 质控标准 阴性及空白对照质控标准为：阴性对照及空白对照应无典型扩增信号，否则此次检测视为无效。 阳性对照质控标准为：阳性对照应出现典型的扩增信号，且其终点荧光信号值超过荧光阈值，否则 此次检测视为无效。 检测有效的质控标准为：当阴性对照、阳性对照及空白对照结果同时有效时，可判定检测有效。 8.3 检测数据定性判定 阴性反应为：测试样品没有出现明显的扩增信号，扩增终点荧光信号值位于阈值限之下，同时阴性 对照、阳性对照及空白对照结果均正常，判定该样品为阴性，表示该样品中不含可检出的亚洲韧皮部杆 菌。 阳性反应为：检测样品出现典型的扩增信号，且终点荧光信号值超过荧光阈值；同时阴性对照、阳 性对照及空白对照结果均正常，则判定该样品为阳性，表示该样品中存在亚洲韧皮部杆菌。 8.4 靶标拷贝数的获取 数字RCR仪器可以根据测试样品扩增产物的荧光信号，计算样品中亚洲韧皮部杆菌靶标的拷贝数， 具有超高的检测灵敏度和检测精确性。扩增产物荧光信号的检测方式为读取FAM通道的荧光信号，然后 通过机载软件进行泊松分布概率密度函数分析，对起始样品进行绝对定量，直接 给出样品中亚洲韧皮部 杆菌的靶标拷贝数。 4 DB44/T 2220—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 柑橘黄龙病菌非洲韧皮部杆菌和美洲韧皮部杆菌的检测方法 A.1 反应体系及程序 参照7.2.1、7.2.3的内容。 A.2 非洲韧皮部杆菌的检测引物及探针 非洲韧皮部杆菌的特异引物及探针参照文献（Li et al., 2006）选用： a) 上游引物 HLBaf-F：5'-CGAGCGCGTATTTTA -3'； b) 下游引物 HLB-R：5'-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG -3'； c) 探针 HLB-P：FAM 5'-AGACGGGTGAGTAACGCG -3' BHQ。 A.3 美洲韧皮部杆菌的检测引物及探针 美洲韧皮部杆菌的特异引物及探针参照文献（Li et al., 2006）选用： a) 上游引物 HLBam-F：5'- GAGCGAGTACGCAAGTACTAG-3'； b) 下游引物 HLB-R：5'-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG -3'； c) 探针 HLB-P：FAM 5'-AGACGGGTGAGTAACGCG-3' BHQ。 上述引物的检测靶标均为：相应柑橘黄龙病菌的16S rDNA。 上述探针5'端荧光报告基团均为FAM，3'端淬灭基团均为BHQ； A.4 结果判定 参照8结果判定的内容。 5 DB44/T 2220—2019 BB 附 录 B （规范性附录） 样品采集信息 B.1 植物样品采集信息 植物样品采集信息应包括：样品来源、样品品种、样品树龄、目测症状、采集地点、采集时间及采 集人等。