ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3821—2019 鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范 Diagnostic techniques for novel duck reovirus disease 2019 - 12 - 24 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 01 - 24 实施 发 布 DB37/T 3821—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所。 本标准主要起草人：于可响、宋敏训、李玉峰、马秀丽、刘存霞、姜亦飞、胡峰、亓丽红、黄兵、 郭效珍、刘玉山。 I DB37/T 3821—2019 鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范 1 范围 本标准规定了鸭新型呼肠孤病毒病的临床诊断、实验室诊断和综合判定技术规范。 本标准适用于鸭新型呼肠孤病毒病的诊断和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鸭新型呼肠孤病毒病 又称“肉鸭脾坏死症”、“番鸭出血性坏死性肝炎”，是由鸭新型呼肠孤病毒引起的多品种雏鸭脾 脏出血和坏死为主要特征的疾病。该病毒在血清学和基因序列上与原有的番鸭呼肠孤病毒有明显差异。 4 临床诊断 4.1 流行病学 该病一年四季均可发生，不同品种的鸭均可发病，如樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等；发病日龄 一般为5～25日龄，其中以5～10日龄居多，病程5～7天。 4.2 临床症状 病鸭精神沉郁，发育不良，部分拉白色稀粪，一般不会出现神经症状，容易继发鸭疫里默氏杆菌、 大肠杆菌等细菌感染。发病率5 %～35 %，死亡率20 %以下。 4.3 病理变化 脾脏表面出血或坏死是其主要病变特征。 4.4 结果判定 1 DB37/T 3821—2019 符合4.1流行病学特征，病鸭出现4.2临床症状和4.3病理变化，可判为鸭新型呼肠孤病毒病疑似病 例，应进行实验室确诊。 5 实验室诊断 除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682二级水的规定；实 验室生物安全要求按照GB 19489执行。 5.1 病原分离鉴定 5.1.1 仪器和设备 5.1.1.1 高速冷冻离心机。 5.1.1.2 恒温培养箱。 5.1.2 试剂或材料 5.1.2.1 青链霉素（青霉素 10 000 IU/mL，链霉素 10 000 µg/mL）。 5.1.2.2 0.22 µm 微孔滤器。 5.1.2.3 8 日龄～9 日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚。 5.1.3 病料处理 按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1 g～2 g，加入10倍体积生理盐水和终浓度2 000 IU/mL的 青链霉素，剪碎后充分研磨，反复冻融2次～3次，8 000×g离心20 min，取上清液用0.22 µm微孔滤器 过滤，经菌检无菌后用于病原分离。 5.1.4 操作步骤 5.1.4.1 取 5.1.3 中处理好的上清液经尿囊腔接种 8 日龄～9 日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚， 0.1 mL/枚，共 5 枚。封口后置于 37 ℃恒温箱继续孵化，每日照胚两次，记录鸭胚死亡情况，观察到 第 6 天。 5.1.4.2 弃掉接种后 24 h 内死亡的鸭胚，若接种 6 天内鸭胚出现死亡，则收集死亡鸭胚的尿囊液，用 5.2、5.3、5.4 中的任意一种方法进行鉴定；若接种 6 天内鸭胚不出现死亡，则收集 6 天活胚的尿囊液， 用 5.2、5.3、5.4 中的任意一种方法进行鉴定。 5.1.5 结果判定 5.1.5.1 阳性：接种后死亡鸭胚或接种后 6 天活胚的尿囊液用 5.2、5.3、5.4 中的任意一种方法检测 为阳性。 5.1.5.2 阴性：接种后死亡鸭胚或接种后 6 天活胚的尿囊液用 5.2、5.3、5.4 中的任意一种方法检测 为阴性。 5.2 RT-PCR 方法 5.2.1 仪器和设备 5.2.1.1 高速冷冻离心机。 5.2.1.2 PCR 扩增仪。 5.2.1.3 电泳仪。 2 DB37/T 3821—2019 5.2.1.4 紫外分析仪。 5.2.2 试剂或材料 5.2.2.1 5.2.2.2 5.2.2.3 5.2.2.4 5.2.2.5 5.2.2.6 5.2.2.7 5.2.2.8 5.2.2.9 TRIZol。 无 RNA 酶水。 反转录酶 M-MLV。 RNA 酶抑制剂。 Taq 酶。 琼脂糖。 Goldview DNA 染料。 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 阴性参照物（阴性尿囊液）。 5.2.3 操作步骤 5.2.3.1 样品处理 按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1 g～2 g，加入10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于研 磨器中充分研磨，反复冻融2次～3次，8 000×g离心10 min，取上清液100 μL用于RNA提取。 5.2.3.2 RNA 提取 5.2.3.2.1 在 100 µL 病料上清液中加入 1 mL TRIZol，剧烈颠倒 50 次～100 次，室温静置 10 min 后， 加入 200 µL 氯仿，上下颠倒 50 次～100 次，室温静置 5 min～10 min，12 000×g 离心 10 min。 5.2.3.2.2 吸取上清加入等体积氯仿，上下颠倒 50 次～100 次，12 000×g 离心 10 min。 5.2.3.2.3 吸取上清加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后，-20 ℃静置至少 30 min，然后 12 000×g 离 心 15 min～20 min。 5.2.3.2.4 弃上清液，加入 1 mL 75 %酒精，12 000×g 离心 5 min～10 min。 5.2.3.2.5 弃上清液，倒置自然晾干，或 12 000×g 再离心 5 min，吸掉管底部的液体。 5.2.3.2.6 沉淀用 20 µL 无 RNA 酶水溶解，备用。阳性和阴性参照物 RNA 的提取同上。样品 RNA 提取 也可使用同等效果的商品化试剂盒。 5.2.3.3 引物 上游引物P1：5' TCATTCATTTGGGCAGCGG 3' 下游引物P2：5' AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT 3' 5.2.3.4 RT-PCR 扩增 5.2.3.4.1 反转录（RT）反应 反应体系为10 µL。在PCR管中加入dNTP(10 mmol/L) 0.8 µL，引物P1(20 µmol/L) 0.5 µL，引物P2(20 µmol/L) 0.5 µL，RNA 5.0 µL，放PCR仪中70 ℃作用5 min，然后取出冰浴1 min～2 min，再加入RNA 酶抑制剂(40 U/µL) 0.5 µL，反转录酶M-MLV(200 U/µL) 0.7 µL，5×M-MLV buffer 2 µL，继续放PCR 仪中42 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min。 5.2.3.4.2 PCR 扩增 5.2.3.4.2.1 反应体系 3 DB37/T 3821—2019 反应体系为50 µL，配制见表1。 表1 PCR 反应体系配制 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量/µL 10×PCR buffer 4.5 20 µmol/L 引物 P1 0.5 20 µmol/L 引物 P2 0.5 RT 产物 5.0 5 U/µL Taq E 0.5 ddH2O 39.0 总体积 50.0 5.2.3.4.2.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： ——第一阶段：95 ℃ 3 min； ——第二阶段：95 ℃ 20 s，55 ℃ 20s，72 ℃ 30 s，共进行 30 个循环； ——第三阶段：72 ℃ 10 min。 RT-PCR扩增也可使用商品化的RT-PCR试剂盒，按说明书要求操作。 5.2.3.5 电泳 取PCR扩增产物6 µL与10×上样缓冲液1 µL混合，加入到1.5 %的琼脂糖凝胶孔中，同时在旁边点样 孔中加入2 000 bp Ladder Marker（分子量标准物）10 µL，以5 V/cm电压进行电泳25 min～30 min， 在紫外分析仪上观察结果。 5.2.4 结果判定 5.2.4.1 试验成立条件 在阳性对照出现一条大小226 bp的单一条带，同时阴性对照无此条带的情况下，检测结果成立。 5.2.4.2 结果判定 被检样品出现与阳性对照同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性对照同样大小的条 带时，判为阴性。参见附录A。 5.3 荧光 RT-PCR 方法 5.3.1 仪器与设备 5.3.1.1 高速冷冻离心机。 5.3.1.2 荧光定量 PCR 扩增仪。 5.3.2 试剂或材料 5.3.2.1 TRIZol。 5.3.2.2 无 RNA 酶水。 5.3.2.3 SYBR Green 荧光 RT-PCR 反应液（2×SYBR Premix）。 4 DB37/T 3821—2019 5.3.2.4 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.3.2.5 阴性参照物（阴性尿囊液）。 5.3.3 操作步骤 5.3.3.1 样品处理 参见5.2.3.1。 5.3.3.2 RNA 提取 参见5.2.3.2。 5.3.3.3 引物 上游引物P3：5' ATCGCACTATTGACGCACTT 3' 下游引物P4：5' TTGACGACGCCAATCCC 3' 5.3.3.4 荧光 RT-PCR 扩增 5.3.3.4.1 反转录（RT）反应 参见5.2.3.4.1。 5.3.3.4.2 荧光 PCR 5.3.3.4.2.1 反应体系 反应体系为25.0 µL，配制见表2。 表2 荧光 PCR 反应体系配制 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量/µL 2×SYBR Premix 12.5 20 µmol/L 引物 P3 0.5 20 µmol/L 引物 P4 0.5 RT 产物 1.0 ddH2O 10.5 总体积 25.0 5.3.3.4.2.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： ——第一阶段：95 ℃ 45 s； ——第二阶段：95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40 个循环，每次循环在