65.150 ICS B 50 DB 12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 865—2019 水和沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量的 测定 液相色谱串联质谱法 Determination of nitrofuran metabolic residues in waters and sediment by LC-MS/MS method 2019 - 01 - 14 发布 2019 - 02 - 15 实施 天津市市场监督管理委员会 发 布 DB12/T 865—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（天津）。 本标准主要起草人：李春青、陈永平、高丽娜、时文博、李宝华。 I DB12/T 865—2019 水和沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱串联质谱 法 1 范围 本标准规定了水及沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量测定的试剂、仪器设备、测定步骤、计算、方 法灵敏度、方法回收率、方法精密度。 本标准适用于水和沉积物中 3-氨基-2-唑烷基酮（呋喃唑酮代谢物，以下简称：AOZ）、5-甲基吗 啉-3-氨基-2-唑烷基酮 （呋喃它酮的代谢物，以下简称：AMOZ）、氨基脲（呋喃西林代谢物，以下简 称：SEM）和 1-氨基-2-内酰脲（呋喃妥因代谢物，以下简称：AHD）残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 水或沉积物中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下水解，用2-硝基苯甲醛衍生化，经乙酸乙酯液 -液萃取净化后，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。 4 试剂 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 醋酸铵：色谱纯。 4.3 二甲基亚砜：色谱纯。 4.4 2-硝基苯甲醛：色谱纯。 4.5 三水合磷酸氢二钾：优级纯。 4.6 乙酸乙酯：色谱纯。 4.7 乙腈：色谱纯。 4.8 盐酸：优级纯。 4.9 0.002 mol/L 醋酸铵溶液：称取 0.15 g 醋酸铵，用水（实验用水当符合 GB/T 6682 规定）溶解并 定容至 1000 mL。 4.10 甲醇溶液： 甲醇：水=5：95(v/v）。 4.11 0.2 mol/L 盐酸溶液：量取浓盐酸（ρ =1.19 g/mL）16.67 mL，用水稀释至 1000 mL。 4.12 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：称取 0.037 8 g 2-硝基苯甲醛，溶于 5 mL 二甲基亚砜中，现 用现配。 4.13 1.0 mol/L 磷酸氢二钾溶液：称取 114 g 三水合磷酸氢二钾，溶解于 500 mL 水中。 1 DB12/T 865—2019 4.14 标准物质 AOZ、AMOZ、SEM·HCl 和 AHD·HCl：纯度≥98% 。 13 15 13 4.15 同位素内标溶液：AOZ-D4、AMOZ-D5、SEM•HCl- C- N2 和 AHD C3，浓度均为 100 μ g／mL。 4.16 AOZ（呋喃唑酮代谢物）标准储备溶液：1.0 mg/mL：准确称取 10.0 mg±0.1 mg AOZ，用甲醇溶 解并定容至 10 mL 棕色容量瓶中，-20℃冷藏保存，有效期 6 个月。 4.17 AMOZ（呋喃它酮代谢物） 标准储备溶液：1.0 mg/mL：准确称取 10.0 mg±0.1 mg AMOZ ，用甲 醇溶解并定容至 10 mL 棕色容量瓶中，-20℃冷藏保存，有效期 6 个月。 4.18 SEM （呋喃西林代谢物） 标准储备溶液 ：1.0 mg/mL：准确称取 14.9 mg±0.1mg SEM ·HCl ， 用甲醇溶解并定容至 10 mL 棕色容量瓶中，-20℃冷藏保存，有效期 6 个月。 4.19 AHD（呋喃妥因代谢物）标准储备溶液：1.0 mg/mL：准确称取 13.2 mg±0.1 mg AHD·HCl，用 甲醇溶解并定容至 10 mL 棕色容量瓶中，-20℃冷藏保存，有效期 6 个月。 4.20 硝基呋喃类代谢物混合标准工作溶液：准确吸取 AOZ、AMOZ、SEM 和 AHD 标准储备溶液，用水逐 级稀释配成 100 ng/mL 和 10 ng/mL 混合溶液，4℃冷藏保存，有效期 1 个月。 4.21 硝基呋喃类代谢物混合内标工作溶液：准确吸取同位素内标溶液（4.15），用水逐级稀释配成 100 ng/mL 混合溶液，4℃冷藏保存，有效期 1 个月。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 液相色谱串联四极杆质谱仪：配备电喷雾（ESI）离子源。 电子天平：感量 0.000 1 g 和 0.01 mg。 涡旋混合器。 恒温水浴振荡器：可控温 37 ℃ ± 1 ℃。 离心机：4 000 r/min。 氮气吹干仪。 冰箱：具备 4 ℃冷藏功能。 6 测定步骤 6.1 样品处理 6.1.1 水样 取充分混匀的水样 100 mL 用 0.45 μ m滤膜过滤，于4 ℃冰箱保存。 6.1.2 沉积物 取沉积物样品 100 g，风干至内外部均干燥无水后，研磨成粉状，用80目圆筛筛分去除大型颗粒， 于4 ℃冰箱保存。 6.2 水解和衍生化 6.2.1 水样品 量取 10 mL（精确到0.1 mL，V2）水样于 50 mL离心管中，加入 0.05 mL混合内标工作溶液（4.21） 涡旋混合 50 s，再加入 5 mL盐酸溶液（4.11）和 0.20 mL 2-硝基苯甲醛溶液（4.12），涡旋振荡50 s 后，置于恒温水浴振荡器中 37℃ 避光振荡 16 h。 6.2.2 沉积物样品 2 DB12/T 865—2019 称取样品 5.00 g（精确到0.01 g，m），加入 0.05 mL混合内标工作溶液（4.21）涡旋混合 50 s， 再加入 5 mL盐酸溶液（4.11）和 0.20 mL 2-硝基苯甲醛溶液（4.12），涡旋振荡 50 s后，置于恒温 水浴振荡器中 37 ℃ 避光振荡 16 h。 6.3 提取净化 取出离心管冷却至室温，加入 3 mL ~ 5 mL 磷酸氢二钾溶液（4.13），调节 pH 至 7.0 ~ 7.5， 加入 8 mL 乙酸乙酯，涡旋振荡 50 s，4000 r/min 离心 5 min，取上层清液至 20 mL 玻璃离心管中， 再加入 8 mL 乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液于 40 ℃ 下氮气吹干。准确加入 1.0 mL（V1）甲醇 溶液（4.10）涡旋振荡溶解残留物，用 0.22 μ m 滤膜过滤，待测。（若样品杂质较多，可考虑定容后 用正己烷净化，即加入 2 mL 正己烷涡旋离心后弃去上层，取下清液过 0.22 μ m 微孔滤膜，待测）。 6.4 标准工作曲线制作 分别准确移取 10 ng/mL混合标准工作液（4.20）0.050 mL、0.10 mL和 100 ng/mL混合标准工作液 （4.20）0.020 mL、0.040 mL、0.060 mL、0.080 mL、0.10 mL于 7 个 50 mL离心管中，除不加样品外， 按 6.1.2 和 6.1.3 步骤操作，按 6.3 测定，色谱图参见附录A。 6.5 测定 6.5.1 色谱条件 色谱柱：C18 柱，100 mm × 2.1 mm (i.d.)，5 µm，或其他性能相当的色谱柱； 柱温：40℃； 进样量：20 µL； 流动相：A . 0.002 mol/L 醋酸铵溶液；B. 乙腈；梯度洗脱程序见表 1，平衡时间为 5 min。 表1 流动相梯度洗脱程序 时间（min） 0.0 1.0 4.0 8.0 8.1 10 A（%） 85 85 30 30 85 85 B（%） 15 15 70 70 15 15 流速（ml/min） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 6.5.2 质谱条件 质谱参数应符合以下条件： a) 离子化模式：大气压电喷雾离子源（ESI）,正离子模式； b) 喷雾电压：4 000 v； c) 雾化气压力：35 psi； d) 辅助气流量：3 L /min e) 离子传输毛细管温度：350 ℃； f) 源内碰撞诱导解离电压：10 v； g) 扫描模式：选择反应监测（SRM），选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表 2； h) Q1 半峰宽：0.7 Da； i) Q3 半峰宽：0.7 Da； j) 碰撞气压力：氩气，1.5 mTorr 3 DB12/T 865—2019 表2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量 目标化合物 AOZ （呋喃唑酮代谢物） AOZ-D4 （呋喃唑酮代谢物内标） AHD （呋喃妥因代谢物） 13 AHD- C3 （呋喃妥因代谢物内标） SEM （呋喃西林代谢物） 13 15 SEM- C- N2 （呋喃西林代谢物内标） AMOZ （呋喃它酮代谢物） AMOZ-D5 （呋喃它酮代谢物内标） 母离子(m/z) 236 236 240 249 249 252 209 209 212 335 335 340 子离子(m/z) 104 * 134 * 134 104 * 134 * 134 * 166 192 * 168 262 * 291 * 296 碰撞能量(v) 19 15 12 20 12 15 12 10 11 22 14 12 注：*表示为定量离子 6.5.3 定性依据 在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在 ±5 % 以内，且检测 到的离子的相对丰度，用与最强离子（基峰）的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度 一致，校正标准可以是校正标准品溶液，也可以是添加了标准物质的样品。次强碎片离子丰度与基峰丰 度比应符合表 3 要求： 表3 基峰与次强碎片离子丰度比要求 次强碎片离子相对丰度（%） 允许相对偏差(%) ＞ 50 ± 20 ＞ 20 ～ 50 ± 25 ＞10 ～ 20 ± 30 ≤ 10 ± 50 6.5.4 定量测定 定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片（表 2）。 6.6 空白实验 除不加试祥外，按上述 6.2、6.3 测定步骤和 6.5 测定条件进行测定，色谱图参见附录B。 7 结果计算 7.1 用仪器自带工作站按内标法进行自动计算，以化合物上机响应的峰面积与内标物峰面积比值为纵 坐标、化合物浓度与内标物浓度比值为横坐标，绘制标准曲线，再根据样品的峰面积响应值与内