i 水中嗜肺军团菌检验方法 ——酶底物法 Examination method for Legionella pneumophila in Water — Enzyme substrate method 2022-09-30发布 2022-11-01实施 团体标准 T/WSJD 26—2022 ICS 91.140.30 CCS C 51 中国卫生监督协会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/WSJD 26 —2022 I 目 录 前言………………………………………………………………………………………… II 1 适用范围 ……………………………………………………………………………………1 2 规 范 性 引 用 文 件 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 3 术 语 和 定 义 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 4 方法原理 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 5 干 扰 和 消 除 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 6 仪 器 和 设 备 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 7 培 养 液 和 试 剂 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 8 样 品 采 集 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 9 检验步骤 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 10 方法灵敏度和特异度 ………………………………………………………………………… 3 11 质量控制 ………………… ……………………………………………………………… 3 12 实验室生物安全 ……………………………………………………………………… 3 附录A（规范性附录）培养基成分 ……………………………………………………4 附录B（ 资 料 性 附 录 ） 判 读 结 果 参 考 图 … … … … … … … … … … … … … … … … … 5 全国团体标准信息平台 T/WSJD 26 —2022 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国卫生监督协会提出并归口。 本文件的附录A为规范性附录，附录 B为资料性附录。 本文件起草单位： 武汉市疾病预防控制中心， 山东省疾病预防控制中心， 北京市疾病预防控制中心， 东莞市疾病预防控制中心，泰安市疾病预防控制中心，爱德士生物制品贸易（上海）有限公司，上海华 测品标检测技术有限公司。 本文件主要起草人：王芳，陈智，胡彬，杨丽华，叶雪仪，张新峰，张梦娇，王怀记，崔梦菲，陈 卫东。 全国团体标准信息平台 T/WSJD 26—2022 1 水中嗜肺军团菌检验方法 ——酶底物法 1 适用范围 本文件规定了水中嗜肺军团菌酶底物检验方法的原理、设备试剂、检测步骤、结果报告、质量控制 等。 本文件适用于非饮用水中嗜肺军团菌的测定，生活饮用水可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件 中的内容通过本 文的规范性引用而构成本 文件必不可少的 条款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本 文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS 394 公共场所集中空调通风系统卫生规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 方法原理 嗜肺军团菌通过诊断酶在特定的培养基中分解底物，释放出褐色指示物或不带有褐色的混浊指示 物，指示检测样品中嗜肺军团菌的存在。 5 干扰和消除 样品中残留的消毒剂、重金属离子对检测结果会造成干扰，需要时，应在样品采集前在采样瓶中加 入硫代硫酸钠溶液（ 6.3）和乙二胺四乙酸二钠溶液（ 6.4）消除干扰。 6 仪器和设备 6.1 无菌采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 500 mL广口玻璃瓶。 6.2 量筒： 100 mL（具 1 mL刻度）。 6.3 无菌带盖试管： 5 mL。 6.4 无菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL 刻度）或微量移液器及无菌吸头。 6.5 无菌锥形瓶或取样瓶： 100 mL。 6.6 培养盘：培养用无菌塑料盘，含 6个大孔， 90个小孔。其中，每个小孔可容纳 0.187 mL 培养 液，大孔可容纳 20 mL培养液。 6.7 恒温培养箱：温度（ 37±0.5）℃，相对湿度约 80%。 6.8 程控定量封口机。 全国团体标准信息平台 T/WSJD 26 —2022 2 6.9 计时器。 7 培养液和试剂 7.1 培养液：按每 100 mL无菌蒸馏水加入 2.02 g培养基（成分详见附录 A或选用市售商品）的比 例配置，盖上瓶盖摇匀直至 培养基完全溶解（或保持浑浊状） ，制成培养液。 7.2 预处理试剂（ 柠檬酸）：称取柠檬酸 2.04 g溶于适量 无菌蒸馏水中，定容至 100 mL。此溶液室 温下保质期为 1年。 7.3 无菌硫代硫酸钠溶液： c（Na2S2O3）= 0.10 mol/L 。称取 15.6g 硫代硫酸钠 （Na2S2O3）溶于蒸 馏水中至 100 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌 20分钟，临用现配。 7.4 无菌乙二胺四乙酸二钠溶液： ρ（C10H14N2O8Na2· 2H 2O）=0.15 g/m L。称取 15 g 乙二胺四乙酸 二钠（C10H14N2O8Na2· 2H 2O）溶于蒸馏水中至 100 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌 20分钟，此溶液保质期 为30天。 7.5 无菌蒸馏水：取适量 蒸馏水，经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20分钟，备用。 7.6 质控菌株 ：嗜肺军团菌标准菌株。 8 样品采集 8.1 采样准备 调查了解采集样品的消毒情况。如采集的是经过氯处理或含有余氯的样品，在 采样瓶（6.1）中加 入无菌硫代硫酸钠溶液（ 7.3）；如采集的是重金属离子含量较高的样品，加入无菌 乙二胺四乙酸二钠 溶液（ 7.4）。硫代硫酸钠溶液 按每125 mL容积 0.1 mL的量加入， 乙二胺四乙酸二钠溶液 按每125 mL 容积 0.3 mL 的量加入。 8.2 样品采集 8.2.1 样品采集：集中空调冷却水、冷凝水样采集按照 WS 394 规定执行；淋浴水样采集时，需先用 酒精棉签擦拭花洒消毒，然后放水 1min后采集；温泉水可在水面下 10cm-15cm处采集，其他水样可 参照 WS 394 要求进行采集。 8.2.2 每个采样点依无菌操作取 样品约500 mL。样品的来源，数量等需登记，并同样品一起送到实 验室。 安全警示 ：为安全起见， 采样时应做好适当防护。采集空调冷却水时， 采样前应关 闭冷却塔风机 ，采样 人员应戴齐肘的橡胶手套取 样品。由于空调连续 运行而不能关闭冷却塔时，则需采样人员佩戴安全护目镜和 呼吸道防护装备等。 8.3 样品保存 样品采集 后应在 2天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下储存不得超过 15天。 9 检验步骤 9.1 接种 9.1.1 量取混合均匀的 100 mL培养液（7.1）于锥形瓶或取样瓶 （6.5）中，备用。 全国团体标准信息平台 T/WSJD 26—2022 3 9.1.2 在无菌试管 中（6.3）加入 2 mL预处理试剂 （7.2），将充分混匀 的样品无菌移取 2 mL加入 其中混匀，室温放置 60s（±5s）后，再次混合试管内液体 。 9.1.3 量取 2 mL经预处理 的样品（ 9.1.2）加入 100 mL培养液（9.1.1）中混匀。将锥形瓶或取样瓶 中混匀的液体倒入 96孔培养盘（6.6），以手抚平培养盘背面，去除孔穴内气泡，用程控定量封口机 （6.8）封口。 9.2 培养 9.2.1 封口后的 培养盘放入 37℃± 0.5℃、相对 湿度约80%的培养箱培养， 培养盘纸面一面朝下，孔 格一面朝上，最大限度减少液体损失。 培养盘叠放时，需错开叠放，即 培养盘的大孔位于小孔之上， 增加稳固性 ，叠放不要超过 10个培养盘。 9.2.2 培养 3天后开始观察 培养液性