ICS 65.080 CCS B 10 12 天津市 地方标准 DB12/T 1271—2023 有机肥中活性大肠杆菌快速测定 PMA-qPCR 法 Rapid detection of live Escherichia coli in organic fertilizer by PMA -qPCR method (点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 ) 2023 - 11 - 07发布 2023 - 12 - 08实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 1271 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。 本文件起草单位：天津市农业科学院畜牧兽医研究所、农业农村部环境保护科研监测所。 本文件主要起草人： 张蕾、田雪力、池晶晶、路超、杨春蕾、韩静 、王丽丽、白朋勋。 DB12/T 1271 —2023 1 有机肥中活性大肠杆菌快速测定 PMA-qPCR法 1 范围 本文件规定了 有机肥中活性大肠杆菌 PMA-qPCR测定方法的试剂与引物、主要仪器设备、样品采集、 检测步骤和检测结果 等技术内容。 本文件适用于 有机肥中活性大肠杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19438.1 禽流感病毒通用荧光 RT-PCR检测方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 525 有机肥料 3 术语和定义 下列术语和定义 适用于本文件 。 3.1 活性大肠杆菌 live Escherichia coli 在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染的致 病菌。 3.2 暗反应 dark reaction 二氧化碳在植物细胞内，经一连串酵素反应，被还原成为葡萄糖的过程。 3.3 光反应 light reaction 光合作用中，光能转变成为化学能的过程 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PMA：叠氮溴化丙锭（ propidium monoazide ） PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） qPCR：实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR） SYBR Green I：核酸凝胶染料 (SYBR green nucleic acid gel stains) ROX: 参比染料（ ROX reference dye ） 5 原理 DB12/T 1271 —2023 2 PMA是光敏DNA染料，可与 DNA发生不可逆的共价交联反应。 PMA无法透过活性细菌完整的细胞膜，但 可以进入死亡细菌受损细胞膜，并永久修饰其 DNA，阻断DNA的PCR扩增。在强光照射下，游离在溶液中 未与核酸交联的剩余 PMA可与水分子反应，生成没有活性的羟胺。羟胺不会对后续从活细菌提取的 DNA 进行修饰，不影响 DNA正常扩增。 样品经PMA预处理后再进行 DNA提取及PCR扩增， 可以克服常规 PCR无法区分活性细菌与死亡细菌释放 出的游离 DNA的缺陷，有效避免 PCR检测中的假阳性结果。 6 试剂与引物 试剂 6.1 6.1.1 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合 GB/T 6682中二级水的要求。 6.1.2 PMA储备液（ 5μg/μL）：1mg PMA溶于200μL 20%的DMSO溶液中， -20℃避光保存。 6.1.3 PMA工作液：将 PMA储备液以 20% DMSO 溶液稀释 10倍。 6.1.4 0.01 mol/L（pH7.2）PBS：配方见 GB/T 19438.1附录A。 6.1.5 95%乙醇。 6.1.6 DNA提取试剂盒。 6.1.7 SYBR Premix Ex Taq 染料法实时荧光定量试剂盒：内含 TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture ，Mg2+， Tli RNaseH，SYBR Green I 。根据qPCR仪型号选用 ROX或ROX II校正。 6.1.8 qPCR标准品：含有目的基因的克隆质粒，也可采用经纯化后的基因组 DNA。 引物 6.2 大肠杆菌 uidA基因qPCR扩增所用引物见表 1。 表1 大肠杆菌 uidA基因qPCR扩增引物 引物名称 引物序列 引物浓度 扩增产物大小 上游引物 UAL1939b 5’- ATGGAATTTCGCCGATTTTGC -3’ 10μmoL/L 167 bp 下游引物 UAL2105b 5’- ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC -3’ 10μmoL/L 7 主要仪器设备 超净工作台、冰箱（ 0 ℃～4 ℃）、分析天平（精度 0.01g）、恒温震荡培养箱、 LED光解仪（波长 465 nm～475 nm、温度低于 37℃）、低温离心机（最大离心力≥ 12000g）、微型孔板离心机、漩涡震荡 器、核酸自动提取仪、 qPCR仪、超微量分光光度计等。 8 样品采集 采样方法 8.1 应按NY/T 525 中的要求进行采样。 样品缩分 8.2 将采集的样品混匀，用四分法将样品缩分至 500g。 样品运输及保存 8.3 DB12/T 1271 —2023 3 样品在运输过程中宜低温保存， 应在 6小时内送至实验室进行检测。 实验室接样后 不能立即检测的， 应将样品放入 0 ℃～4 ℃冰箱保存，放置时间不应超过 24h。 9 检测步骤 样品制备 9.1 将样品进一步缩分后研磨至全部通过 Ø1mm尼龙筛，混匀。无菌操作下称取样品 10.0g，加入到带玻 璃珠的 90mL无菌PBS缓冲液中， 置于恒温震荡培养箱中， 200r/min震荡 30min。于4℃，1000×g离心10min 收集上清液。 PMA处理 9.2 取1mL上清液至离心管中，加入 0.2mLPMA工作液， PMA终浓度约 为80μg/mL，避光放置 10min。将 离心管置于 LED光解仪，曝光 5min。再将离心管于 4℃，12000×g离心5min，弃上清液，无菌 PBS缓冲液 洗涤2次后重悬。 DNA提取 9.3 可选用等效的商品化核酸提取试剂盒，或选用 核酸自动提取仪及配套试剂，参考 附录A。 qPCR反应 9.4 9.4.1 qPCR反应体系（ 20μL）：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Rox II 0.4 μL，上下游引物各 0.4μL， ddH2O 6.8μL，标准品或样品 DNA 2μL。 9.4.2 qPCR反应程序： 1个循环： 50℃，2 min，95℃，30 s；40个循环： 95℃，5 s，60℃，34 s。 9.4.3 检测过程中设空白对照、阳性对照。样品与对照均设 3个重复。 标准曲线 9.5 提取标准品 DNA，根据公式（ 1）计算出标准品的原始拷贝数。将标准品 DNA用ddH2O连续10倍梯度稀 释4份～6份，进行 qPCR扩增。扩增后，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以 Ct值为纵坐标绘制标准曲 线。 ………………………………………… （1） 式中： Ccopies——基因拷贝数，单位 为copies/mL； CDNA——DNA浓度，单位 为g/mL； L——基因组DNA长度，单位 为bp； NA——阿伏伽德罗常数，取 6.02×1023。 10 检测结果 阈值（Ct）设定 10.1 检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct值直接读取检测结果， Ct值为每个反应管内的荧光信号达到 设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性 样品扩增曲线的最高点为准 。 DB12/T 1271 —2023 4 质控标准 10.2 10.2.1 空白对照无Ct值，且无典型扩增曲线。 10.2.2 阳性对照的 Ct值应＜27.0，并出现典型的扩增曲线。 检测结果确定 10.3 根据样品 Ct值，在绘制出的标准曲线图上得到对应的大肠杆菌的 DNA量。