(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210544667.2 (22)申请日 2022.05.19 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 鲍永美　宋其升　王玮　张红生　 黄骥　王建飞　余耀　唐海娟　 董世楠　张成成　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 傅婷婷　徐冬涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 水稻种子中稻瘟病菌LAMP快速检测方法及 应用 (57)摘要 本发明属于作物分子遗传育种学领域， 公开 了水稻种子中稻瘟病菌的LAMP快速检测方法及 应用， 包括如下步骤： (1)取水稻种子样品， 提取 水稻种子样品基因组DNA。 (2)利用两对引物， 对 水稻种子样品基因组DNA进行环介导等温扩增。 根据反应溶液颜色的变化判断样品中是否含有 稻瘟病菌。 通过本发明提供的方法可以快速准确 的诊断出水稻种子中是否含有稻瘟病菌， 有利于 防治稻瘟病， 减少经济损失。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114774576 A 2022.07.22 CN 114774576 A 1.一种LAMP引物组合物， 其特征在于由SEQ  ID NO.1所示的引物F3， SEQ  ID NO.2所示 的引物B3， SEQ  ID NO.3所示的引物FIP， SEQ  ID NO.4所示的引物BIP， SEQ  ID NO.5所示的 引物LF组成。 2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测水稻种子中稻瘟病菌中的应用。 3.权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备检测水稻种子中稻瘟病菌的试剂中的应 用。 4.一种水稻种子中稻瘟病菌的LAMP快速检测试剂盒， 其特征在于包含权利要求1所述 的LAMP引物组合物。 5.水稻种子中稻瘟病菌的LAMP快速检测方法， 其特 征在于如下步骤： (1)取水稻种子样品， 提取 水稻种子样品基因 组DNA； (2)利用权利要求1所述的LAMP引物组合物对所述的水稻种子样品基因组DNA进行环介 导等温扩增， 扩增结果直接通过反应液颜色变化来判断:如果反应液颜色由由紫罗兰色变 成蓝色， 则水稻种子样品中含有稻瘟病原菌； 如果反应液颜色没有发生变化， 则水稻种子样 品中不含有稻瘟病原菌 。 6.根据权利要求5所述的LAMP快速检测方法， 其特征在于LAMP 反应的体系为： 体积为25 μL， 其中20μM  FIP和BIP引物2μL， 10μM  F3和B3引物0.5μL， 10μM  LF引物1μL， 10mM  dNTPs  3.5μL， 8U/μL  Bst DNA聚合酶1μL， 100mM  MgSO4 1μL， 10×Isothermal  Amplification   Buffer 2.5 μL， 5M Betain solution 4 μL， 2mM HNB 2 μL， DNA模板1 μL。 7.根据权利要求5所述的LAMP快速检测方法， 其特征在于反应条件为： 密闭条件下， 64 ℃恒温扩增5 0min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774576 A 2水稻种子中稻瘟病菌LAMP快速检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于农作物分子遗传育种学领域， 涉及水稻种子中稻 瘟病菌LAMP快速检测 方法及应用。 背景技术 [0002]水稻作为我国重要粮食作物之一， 在保证国家粮食安全方面有着重大的意义。 水 稻生长过程中常常遭受稻瘟病(Rice  blast)的危害， 而稻瘟病菌(Magnaporthe  oryzae, M.oryzae)作为水稻稻瘟病发生的病原菌， 对 水稻的生长发育产生了严重危害。 播种带菌水 稻种子往往造成苗瘟， 使 水稻秧苗产生病斑甚至枯死。 对水稻种子中的稻瘟病菌进 行检测， 可以提前采取 预防措施， 减少稻瘟病的发生， 对水稻生产有重要意 义。 [0003]LAMP技术(环介导等温扩增技术)是日本学者Notomi在2000年公开的一种新型的 核酸扩增技术(Notomi  T,Okayama  H,Masubuchi  H,et al.Loop‑mediated  isothermal   amplification  of DNA[J].Nucleic  Acids Research,2000,28(12):e63.)， 这是一种能在 恒温条件 下， 对DNA模板的六个区域设计四条引物， 利用链置换性聚合 酶扩增DNA的技术。 因 为其极高的特异 性和灵敏度且 反应在恒温下发生的特性， 环介导等温扩增技术已被广泛运 用于病原 物检测领域。 发明内容 [0004]本发明的目的是： 基于LAMP技术建立一种快速检测 水稻种子中稻瘟病菌的方法， 并采用NaOH溶液粗提法对水稻种子中稻瘟病菌进 行核酸提取， 为农业生产上提供一种方便 快捷、 安全可靠的检测技 术。 [0005]本发明的目的可通过如下技 术方案实现： [0006]一种LAMP引物组合物， 由S EQ ID NO.1所示的引物F3， S EQ ID NO.2所示的引物B3， SEQ ID NO.3所示的引物FIP， SEQ  ID NO.4所示的引物BIP， SEQ  ID NO.5所示的引物LF。 [0007]本发明所述的LAMP引物组合物在检测水稻种子稻瘟病菌中的应用。 [0008]一种检测水稻种子稻 瘟病菌的LAMP快速检测试剂盒， 包含本 发明所述的LAMP引物 组合物。 [0009]LAMP技术(环介导 等温扩增技 术)检测水稻种传稻瘟病菌， 包 含如下操作步骤： [0010](1)取水稻种子样品， 采用NaOH溶液粗提法提取水稻样品基因组DNA:取0.2g待测 水稻种子置于含有小钢珠的2ml试管中， 液氮速冻磨碎好后加入1000 μL的0.5M  NaOH(0.5M   NaOH， 10mM  Na2EDTA)裂解液， 上下轻微摇晃 混匀， 并在室温条件下静置4min。 取上层较清的 研磨提取液， 用TE缓冲液(10mM  Tris， pH8.0， 1mM  EDTA)进行1:30倍数的稀释。 取2.5 μL稀释 液直接用于LAMP扩增。 [0011](2)以水稻稻瘟病菌XM_003710175基因中种内保守、 种间特异的一段203bp序列为 靶标设计引物， 引物的位置如图2所示， 并且这段DNA序列从未被用于稻瘟病菌的检测， 针对 这段DNA序列设计了多组引物， 经过大量的筛选工作， 剔除了那些扩增效果不好、 稳定性差说　明　书 1/4 页 3 CN 114774576 A 3