(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210546680.1 (22)申请日 2022.05.19 (71)申请人 漳州市农业科 学研究所 地址 363000 福建省漳州市龙文区朝阳镇 物华路20号 (72)发明人 赖宝春　姚锦爱　侯翔宇　戴瑞卿　 曾天宝　 (74)专利代理 机构 深圳中创智财知识产权代理 有限公司 4 4553 专利代理师 陈慧 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种蜜柚黑点病菌间作壳菌LAMP检测引物 组、 检测方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种蜜柚黑点病菌间作壳菌 LAMP检测引物组、 检测方法和应用。 用于检测蜜 柚黑点病菌间作壳菌的LAMP引物组由1对外侧引 物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成。 本发明还 提供了一种应用上述引物的蜜柚黑点病菌间作 壳菌LAMP检测方法， 其具体步骤包括： 1)待测样 品DNA提取； 2)LAMP反应体系的建立； 3)结果检 测。 本发明的LA MP反应体系在65℃等温条件下进 行， 通过1h温育便能快速、 方便、 高效、 高特异、 高 灵敏地检测到蜜柚黑点病菌间作壳菌。 本发明不 需要复杂仪器， 能很好地满足对蜜柚黑点病菌间 作壳菌的现场检测， 在蜜柚黑点病菌间作壳菌监 测、 检测和鉴定上 具重要的应用价 值。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图2页 CN 114891915 A 2022.08.12 CN 114891915 A 1.一种蜜柚黑点病菌间作壳菌LAMP检测引物 组， 其特征在于， 所述引物 组由1对外侧引 物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成， 其核苷酸序列如下： 外侧引物F3的氨基酸序列如SEQ  ID NO： 1所示； 外侧引物B3的氨基酸序列如SEQ  ID NO： 2所示； 内侧引物FIP的氨基酸序列如SEQ  ID NO： 3所示； 内侧引物BIP的氨基酸序列如SEQ  ID NO： 4所示。 2.一种利用权利要求1所述引物组检测蜜柚黑点病菌间作壳菌LAMP检测方法， 其特征 在于， 包括以下步骤： (1)提取待测样品DNA； (2)建立LAMP反应体系： 25 μL体系中含有10 ×Thermolpol缓冲液2.5 μL、 8000U/mL的Bst 聚合酶1 μL、 DNA模板2.5 μg、 终浓度为1.6mM的dNTPs  3.5 μL、 终浓度为8mM的MgSO4 1.5 μL、 内 侧引物FIP和BIP各4 μL， 浓度10 μmol/L、 外侧引物F3和B3各2 μL， 浓度10 μmol/L， 余量为超纯 水； (3)LAMP反应条件： 于实时浊度仪中进行反应， 65℃恒温反应60min， 80℃灭活5min结束 反应； (4)反应结果的测定： 采用荧 光染料目测观察法和/或实时浊度法进行测定 。 3.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述荧光染料目测观察法的具体方法 是： LAMP反应结束后， 在反应产物中加入1 μL  SYBR Green I， 反应产物为荧光绿色则表示结 果为阳性， 检测到蜜柚黑点病菌间作壳菌， 反应产 物为橙色则表示结果为阴性， 未检测到蜜 柚黑点病菌间作壳菌 。 4.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述实时浊度法的具体方法是： 浊度 仪根据LAMP扩增过程中生 成的焦磷酸镁的沉淀量以数值的形式记录下来， 然后根据数据制 作成LAMP扩增产物曲线图， 以数据和曲线的形式来反映LAMP扩增结果， 浊度仪出现扩增曲 线。 5.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 提取待测 样品DNA的方法为： 采集新鲜 且有明显症状的蜜柚黑点病病叶， 将其储存在 ‑80℃的冰箱里， 用于检测病原菌纯培养物 时， 采用CTAB法进行提取基因组DNA； 用于检测植物组织中蜜柚黑点病菌时， 采用NaOH快速 裂解法提取DNA。 6.如权利要求1所述的蜜柚黑点病菌间作壳菌LAMP检测引物 组在蜜柚黑点病菌间作壳 菌监测、 检测 和鉴定上的应用。 7.如权利要求2 ‑5任一项所述的蜜柚黑点病菌间作壳菌的LAMP检测方法在蜜柚黑点病 菌间作壳菌的监测、 检测 和鉴定上的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891915 A 2一种蜜柚黑 点病菌间作壳菌LAMP检测引物组、 检测方 法和 应用 技术领域 [0001]本发明属于农作物病害检测、 鉴定及防治技术领域， 具体涉及一种蜜柚黑点病菌 间作壳菌LAMP检测引物组、 检测方法和应用。 背景技术 [0002]蜜柚(pomelo)是漳州平和县的地方名果， 至今已有500多年的栽培历史， 在清代乾 隆年间被列为清廷贡品。 其味道酸甜， 含有丰富的维生素C及大量营养元素， 是现代人追求 健康的理想食物。 1995年被命名" 中国琯溪蜜柚之乡"， 2007年琯溪蜜柚被认定为中国驰名 商标。 2008年， 琯溪蜜柚被认定为中国名牌农产品， 并被欧盟列为地理标志保护品种。 成为 中国柚类第一大县， 被誉为"  世界柚乡， 中国柚都"。 自上世纪80年代开始大面积种植， 主要 销往欧盟、 北美、 俄罗斯、 东南亚等40多个国家和地区的市场。 蜜柚黑点病又称砂皮病、 树脂 病、 褐色蒂腐病， 由间座壳属(Diaporthe)真菌引起， 该属真菌是一类非常重要的植物病原 真菌类群， 它们侵染蜜柚的叶片、 果 实和枝干的表面， 由于 寄主的抗病反应， 分泌胶质， 干燥 后形成凸起的细 小坚硬的斑点， 通常称之为黑点病， 严重时果实表 面形成沙 皮症状。 申请者 从感染黑点病的蜜柚材料上分离到间座壳属真菌70株10个种， 在接种试验中发现， 分离到 的间座壳属真菌除了致病型之外， 还存在内生型和 腐生型， 这类型真菌一方面， 它们的生命 活动利于 寄主植物的生长、 抗病和抗逆； 另外一方面， 它们也可能作为潜在的病原真菌和 腐 生真菌， 在特定的时期侵染寄主植物或者在已经染病的植物组织上形成二次侵染， 也可能 在活体植物组织坏死之后腐生其上。 在一些山地果园， 该病的危害降低果实外观品质尤为 突出， 可引起储运期 间烂果， 发生黑点病的果园病果率一般为5％～30％， 严重时达80％～ 100％。 目前蜜柚黑点病防治存在的问题日益凸显， 一是单纯依靠化学农药， 不重视其他防 治方法。 主要表现为蜜柚果园管理中未进 行发生危害测报， 绿色防控意识淡 薄， 滥用农药现 象普遍， 重治轻防， 多种化学农药的长期使用导致病害抗药性， 需要不断加大施药剂量， 混 淆农药概念等问题。 二是果园管理粗放， 生态环境脆弱。 主要表现在化学肥料施用失衡， 土 壤有机质含量低， 导致面源污染日益严重， 树体负载过大， 造成树体衰弱， 植物生长调节剂 过量使用， 果品质量下降， 次要病害 上升为主要病虫， 这些问题均会加重病害的发生。 因此， 为解决上述问题， 在蜜柚果园管理中对黑点病的发生进行实时监测检测及其重要， 通过监 测和检测可以提 早做好预测 测报， 能够做到早预防， 早治疗， 可 大大减轻病害发生及 传播。 [0003]环介导等 温扩增(loop ‑mediated  isothermal  amplification,LAMP)是日本学者 Notomi公开发表的一种 新型的， 适用于基因鉴定的核酸扩增技术。 在  60‑65℃恒温以及链 置换DNA聚合酶催化的条件 下， 特异性的针对靶基因的6  个区域设计LAMP引物， 能与目标序 列的两端结合循环产生环状单链结构， 不断的产生新链的合成， 15 ‑60min即可实现目标基 因高效扩增， 便可将目的基因片段扩增到109‑1010个数量级， 反应中产生副产物焦磷酸镁沉 淀可通过肉眼观察， 可以看到明显的白色沉淀， 为了更加 准确的对副产物焦磷酸镁沉淀进 行定时定量的监控， 可通过实时浊度仪检测浊度来观察结果。 LAMP方法和PCR反应相比， 其说　明　书 1/8 页 3 CN 114891915 A 3