(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210558042.1 (22)申请日 2022.05.19 (71)申请人 江苏谱新 生物医药有限公司 地址 215104 江苏省苏州市吴中经济技 术 开发区越溪街道吴中大道1463号越旺 智慧谷A4 号楼整幢 (72)发明人 刘丽美　李查　张天扬　张煜晗　 郑孟韬　蔡宇卿　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种Human DNA残留检测试剂盒及其检测方 法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种Human  DNA残留检测试剂 盒， 通过在常规PCR基础上加入特定荧光标记引 物探针制备得到Human  DNA残留检测试剂盒， 实 现了对Human残留DNA的定量 分析。 该试剂盒的扩 增效率高， 特异性强， 精确度、 灵敏度高， 可重现 性好， 具有优异 的冻融稳定性。 试剂盒简化qPCR 反应操作的反应液配置时的操作步骤， 减少操作 者的工作量， 节约整个操作时间， 且若是用于连 续性检测， 可使检测结果更具比较性。 此外， 该试 剂盒通过两步法反应快速扩链， 检测速度快， 专 一性强， 性能可靠， 最低检测限可以达到fg水平。 可用于重组 蛋白药、 抗体药、 疫 苗、 细胞与基因药 物等领域中定量检测各种生物制品的中间品、 半 成品及成品中Human宿主细胞DNA。 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 CN 115466781 A 2022.12.13 CN 115466781 A 1.一种Human  DNA残留检测试剂盒， 其特征在于， 其包括如下组成成分： Human  DNA定量 参考品、 引物探针、 qPCR  Reaction Buffer、 DNA稀释液。 2.如权利要求1所述的一种Human  DNA残留检测试剂盒， 其特征在于， 所述Human  DNA定 量参考品为293T基因组DNA。 3.如权利要求1所述的一种Human  DNA残留检测试剂盒， 其特征在于， 所述引物探针过 包括引物、 探针。 4.如权利 要求1或3所述的一种Human  DNA残留检测试剂盒， 其特征在于， 所述引物和探 针的体积比为(1～ 2)： (0.2～0.5)。 5.如权利要求1所述的一种Human  DNA残留检测试剂盒， 其特征在于， 所述qPCR   Reaction Buffer的组成 成分包括： FastFire  qPCR PreMix(Probe)和无酶水。 6.一种如权利要求1～5任一项所述的Human  DNA残留检测试剂盒的检测方法， 其特征 在于， S1.制备系列浓度梯度的标准溶液： 将Human  DNA定量参考品、 DNA稀释液置于冰上融 化后瞬时离心， 然后用DNA稀释液将Human  DNA定量参考品稀释， 振荡混匀后 快速离心10s， 得到系列浓度梯度的标准溶 液； S2.制备qPCR反应液： 根据系列标浓度梯度的标准溶液及待测 样本的数量， 确定所需96 孔板的反应孔数、 进行实验用的各 试剂需要的量； S3.加样并测试： 每孔加入qPCR反应液qPCR  MIX 15 μL和样品5 μL， 加样完成后将96孔板 轻微振荡混匀， 快速 离心10s后放入qPCR仪； S4.qPCR结果分析： 对qPCR仪测试 结果进行分析以及报告结果。 7.如权利要求6所述的一种Human  DNA残留检测试剂盒的检测方法， 其特征在于， 所述 qPCR反应液qPCR  MIX的制备方法为： 将qPCR  Reaction  Buffer和引物探针分别置于冰上融 化， 轻微震荡混合均匀， 然后按比例进行混合。 8.如权利 要求6或7所述的一种Human  DNA残留检测试剂盒的检测方法， 其特征在于， 所 述每孔qPCR反应液qPCR  MIX包括12 ～14 μL qPCR Reaction Buffer和1～3 μL引物探针。 9.如权利要求1所述的一种Human  DNA残留检测试剂盒的检测方法， 其特征在于， 所述 qPCR仪的程序参数为： 预变性的温度为94～97℃， 时间为8～12min； 变性的温度为94～96 ℃， 时间为7～15s； 延伸的温度为5 5～65℃， 时间为10～3 0s， 循环次数为3 5～45次。 10.一种如权利要求1～5任一项所述的Human  DNA残留检测试剂盒的应用， 其特征在 于， 其用于 定量检测各种生物制品的中间 品、 半成品及成品中Human宿主细胞DNA。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115466781 A 2一种Human DNA残留检测试剂盒及其检测方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及的是DNA检测技术领域， C12Q1/6851， 尤其涉及一种Human  DNA残留检 测试剂盒及其检测方法和应用。 背景技术 [0002]生物制品常用于可预防、 治疗疾病， 关系到使用者的用药安全， 所以产品质量尤为 重要， 而其中生物制品中宿主细胞残 留DNA具有潜在致瘤和传染风险， 对DNA杂质的限量要 求非常严格。 qPCR反应目前在生物技术领域的应用较光， 可以将qPCR技术可以用于任何 DNA、 RNA相关的检测。 qPCR反应存在重要的五因素： 标准品、 引物探针、 预混液、 DNA稀释液、 反应体系。 [0003]专利CN202110371867.8公开了一种用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物 和探针及实时荧光定量PCR试剂盒， 包括特异性引物和探针、 阳性质粒标准品、 Taq  DNA酶、 UDG酶、 dNTP、 Tris ‑HCl、 KCl、 MgCl及其缓冲液， 探针中5 ’端标记的荧光报告基团为FAM， 3 ’端 标记的荧光淬灭基团为TAMRA， 可以实现定性或定量检测或辅助检测MDCK细胞残留DNA含 量， 灵敏度高， 成本低， 检测迅速。 专利CN201110066745.4公开了一种用于CHO细胞DNA残留 检测的试剂盒及其使用方法， 包括正向引物CHO ‑F、 反向引物CHO ‑R、 Taq酶、 dNTPs、 Rox染料、 Mg2+及PCR缓冲液， 该试剂 盒特异性、 灵敏度高。 但是在实际操作时， 需要操作者在上机检测 前进行PCR反应液的配置， 该过程繁琐， 且操作者很难保证不同批配置的反应液是完全一样 的， 精密度较差。 若 是用于比较进 行工艺开 发需要比较样 本的前后差异， 其数据可靠性难以 让人信服。 发明内容 [0004]为了解决上述问题， 本 发明第一方面提供了一种Hu man DNA残留检测试剂盒， 其包 括如下组成 成分： [0005]Human DNA定量参考品、 引物探针、 qPCR  Reaction Buffer、 DNA稀释液。 [0006]所述Human  DNA定量参考品为293T基因组DNA。 [0007]所述Human DNA定量参考品是由添加RNA酶后通过特定的结合液和蛋白酶K迅速裂 解细胞和灭活细胞内核酸酶， 随后通过吸附柱、 漂洗、 离心得到 。 [0008]所述RNA酶为 l RNaseA酶。 [0009]所述引物探针过包括引物、 探针。 [0010]所述引物和探针的体积比为(1～2)： (0.2～0.5)； 优选地， 所述引物和探针的体积 比为1.2： 0.4。 [0011]所述探针为MGB  Eclipse探针， 包 含一个5’端荧光探针、 一个3 ’端猝灭基团。 [0012]qPCR‑荧光探针法测定样本中Hum an残留DNA具有特异性强， 敏感性高的优势， 但引 物探针对PCR定量检测Human  DNA残留具有重要影响。 本申请人发现， 在上述体系中加入正 向引物和反向引物两种引物 时， 能够通过碱基互补牢固结合于两个反应DNA序列的任何一说　明　书 1/9 页 3 CN 115466781 A 3