(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210535699.6 (22)申请日 2022.05.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114634990 A (43)申请公布日 2022.06.17 (73)专利权人 中国水产科 学研究院珠 江水产研 究所 地址 510380 广东省广州市荔湾区西塱兴 渔路1号 专利权人 广州奕昕生物科技有限公司 (72)发明人 谭爱萍　涂传明　邓玉婷　赵飞　 黄志斌　 (74)专利代理 机构 广州专理知识产权代理事务 所(普通合伙) 44493 专利代理师 张凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/365(2006.01) (56)对比文件 CN 105176997 A,2015.12.23 CN 101962678 A,201 1.02.02 CN 113186319 A,2021.07.3 0 CN 105602945 A,2016.0 5.25 陈国权等.鰤鱼诺卡氏菌特异性PCR检测方 法的建立. 《基因 组学与应用生物学》 .2020,第40 卷(第7-8 期),第26 56-2665页. 王亚楠等.重组酶聚合酶扩增技 术研究进 展. 《解放军医学杂志》 .2021,第46卷(第5期),第 504-510页. Jonas Kissenköttera等.Devel opment of a pan-ricket tsial mo lecular dia gnostic test based o n recombi nase polymerase amplification assay. 《Analytical Biochemistry》 .2017,第54 4卷第29-33页. 审查员 徐丹 (54)发明名称 一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、 探针 以及检测方法 (57)摘要 本发明属于生物检测的技术领域， 具体涉及 一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、 探针以及 检测方法。 所述RPA引物中引物F和R的核酸序列 分别如序列表SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示， 所述探针的核酸序列如序列表SEQ  ID NO.3所 示。 本发明的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和 探针， 从临床判断为感染或疑似感染鰤诺卡氏菌 组织中快速准确地检测岀鰤诺卡氏菌， 该方法体 现出较强的特异性， 以及其检测灵敏度均较常规 PCR更高， 检测限度达到60  pg/μL， 还可以对不 同来源的鰤诺卡氏菌进行检测， 这对鰤诺卡氏菌 病的早期诊断、 早期治疗等方面具有重要意义， 同时还可以免除高昂的仪器投入， 便于基层推广使用。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114634990 B 2022.09.09 CN 114634990 B 1.一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA检测组合， 其特征在于， 所述检测组合包括RPA引物 和探针； 所述RPA引物F和R的核酸序列分别如序列表SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示： 引物F： 5’ ‑CGCGGATGTGGGCCACAACGTCGAACGCCT‑3’； 引物R： 5’ ‑GGAACCCGTGAAAATGCGAGTGATCAGTG G‑3’； 所述探针根据所述的RPA引物设计得到， 所述探针的大小为30~45bp， 其5 ’端用FAM标 记， 3’端进行C3 Spacer修饰， 且在探针中间距离 5’端30bp处进行THF修饰； 所述探针的核酸序列如序列表SEQ  ID NO.3所示： 探针P： 5 ’ ‑FAM‑AGATTGCGAATCGCCAAGTGCTCGTCCGCA[FAM ‑dT][THF][BHQ ‑dT] CGAACGGGGTCGTAG(C 3 Spacer)‑3’。 2.一种基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括如权利要求 1所述的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA检测组合。 3.一种非疾病诊断的基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1） 提取待测样品中的DNA； 2） 以步骤1） 所提取的DNA为扩增模板， 采用如权利要求1所述的引物F和R、 探针P在RPA 反应管中进行RPA扩增反应； 3） 分析RPA扩增反应得到的产物。 4.根据权利要求3所述的非疾病诊断的基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的方法， 其特征在 于， 步骤2） 所述RPA扩增反应的条件为： 95℃， 30秒， 40℃， 30秒， 40个循环， 95℃， 1分钟终止 反应。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114634990 B 2一种用于 检测鰤诺卡氏菌的R PA引物、 探针以及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测的技术领域， 具体涉及一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、 探针以及检测方法。 背景技术 [0002]鰤诺卡氏菌 （ Nocardia  seriolae ） 是革兰氏阳性丝状杆菌， 属于放线菌目 （Actinomycetales） 、 诺卡氏菌科 （Nocardiaceae） 、 诺卡氏菌属 （Nocardia） ， 1967年在日本 五条鰤 （Seriola quinqueradiata ） 中首次分离发现， 随后陆续在北美、 欧洲、 大洋洲的多种 海水和淡水鱼类中被报道。 该菌宿主范围广， 已在多种鱼类如大黄鱼 （ Larimichthys   crocea） 、 乌鳢 （ Channa argus） 、 大口黑鲈 （ Micropterus  salmoniodes ） 暗纹东方鲀 （Takifugu  obscurus ） 、 罗非鱼( Tilapia mossambica )、 招财鱼( Osphronemus  goramy)等发 现。 鰤诺卡氏菌感染在环境温度为25~28℃时发病最严重， 气温下降后发病情况有所缓解， 该病菌感染持续时间长， 病鱼前期无明显症状， 中期开始表现出少食、 反应迟缓等症状， 后 期出现体表溃烂出血、 肛门红肿、 腹部肿大， 病鱼肝、 脾、 肾、 肌肉等出现大量肉眼可见的白 色结节等临床表现， 从发病到死亡需要2周左右， 自然发病率为35~60%， 如能早期诊断、 早期 治疗常可控制或痊愈， 否则会很难治疗甚至出现大量死亡， 是目前影响加州鲈和乌鳢养殖 产业健康持续 发展的主要病害， 每年因该病带来的经济损失也非常大。 因此， 开发鰤诺卡氏 菌的早期快速检测技 术， 对鰤诺卡氏菌病早期诊断、 早期治疗具有重要的意 义。 [0003]现有的鰤诺卡氏菌病检测方法主要有传统生理生化鉴定方法和分子生物学方法， 其中传统生理生化鉴定方法包括采用生化管鉴定或采用微生物鉴定系统； 分子生物学方法 包括普通P CR和荧光定量P CR方法， 上述方法有的耗时长， 有的需要昂贵的设备， 有的检测灵 敏度不够高或者容易出现假阳性现象， 因此研发灵敏、 快速的检测方法是本领域不断探索 的课题。 [0004]鰤诺卡氏菌是一种生长缓慢的革兰氏阳性菌， 生长周期 为3~7天， 因此传统生理生 化鉴定方法不适合进行诺卡氏菌的快速检测。 例如， 普通PCR操作繁琐、 交叉污染的风险较 高， 检测时间也较长， 一般需要1~1.5 h， 不适合鰤诺卡氏菌的快速检测； 荧光定量PCR方法 的绝对定量依赖于Ct值和标准 曲线， 对于低拷贝的靶基因或模板差异倍速不大的情况下， 该技术的检测敏感性和精确度会受限制； LAMP方法需要使用的引物多达4~6条， 对扩增的目 的基因片段的特异 性要求非常高， 增加了污染风险， 容易出现假阳性的情况； 以及RAA方法， 扩增后需要通过凝胶电泳观察结果， 均不利于现场的快速检测。 发明内容 [0005]针对上述问题， 本发明的目的在于提供一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、 探针 以及检测方法。 [0006]本发明的技 术内容如下： [0007]本发明提供了一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物， 所述RPA引物为基于陈国权等说　明　书 1/6 页 3 CN 114634990 B 3