(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210542888.6 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 江苏省海 洋资源开发研究院 （连云 港） 地址 222000 江苏省连云港市高新区苍梧 路59号 (72)发明人 罗志丹　许恒皓　王欣竹　张新亚　 卢辰　张建　吴芳　 (74)专利代理 机构 北京和联顺知识产权代理有 限公司 1 1621 专利代理师 胡杨 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸 探针及方法 (57)摘要 本发明公开了一组快速检测新冠病毒S基因 点突变的核酸探针及方法， 包括检测新冠病毒S 基因N679K突变的锁式探针PLP ‑1， 超分支滚环扩 增引物组RCA ‑F和RCA‑R以及检测扩增产物所用 sgRNA， 所述检测新冠病毒S基因N679K突变的锁 式探针PLP ‑1， 超分支滚环扩增引物组RCA ‑F和 RCA‑R均为单链DNA； 所述锁式探针PLP ‑1的核苷 酸碱基序列为SEQIDNo.1所示， 其中5 ’端具备磷 酸化修饰； 所述超分支滚环扩增引物组包含2条 引物， 核苷酸碱基序列分别为为SEQIDNo.2和 SEQIDNo.3。 本发明将锁式探针、 超分支滚环扩增 反应和CRISPR/Cas12技术联用， 可以检测长度低 至50nt、 高度降解的碎片化病毒RNA中所含有的 点突变， 操作简单， 灵敏度高， 反应时间短。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图2页 CN 115094163 A 2022.09.23 CN 115094163 A 1.一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针， 包括检测新冠病毒S基因N679K突 变的锁式探针PLP ‑1， 超分支滚环扩增引物组RCA ‑F和RCA‑R以及检测扩增产物所用sgRNA， 其特征在于， 所述检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP ‑1， 超分支滚环扩增引物组 RCA‑F和RCA‑R均为单链DNA； 所述锁式探针PLP ‑1的核苷酸碱基序列为SEQ  ID No.1所示， 其 中5’端具备磷酸化修饰； 所述超分支滚环扩增引物组包含2条引物， 核苷酸碱基序列分别为 为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。 2.根据权利要求1所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针， 其特征在 于： 所述检测扩增产物所用sgRNA的核苷酸碱基序列为SEQ  ID No.4。 3.一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法， 其特征在于： 具体步骤如 下： 步骤一： 获取病毒RNA； 步骤二： 以步骤一获取的RNA为模板， 加入锁式探针PLP ‑1和连接酶， 配制连接反应混合 液， 进行连接反应； 步骤三： 使用超分支滚环扩增引 物组RCA‑F和RCA‑R和具备链置换活性的DNA聚合酶对 步骤二的反应产物进行滚环扩增反应； 步骤四： 检测扩增产物。 4.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病 毒S基因点突变的核酸探针的方法， 其特 征在于： 所述 步骤二中的连接反应中， 所用的连接酶是Spl int R ligase。 5.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病 毒S基因点突变的核酸探针的方法， 其特 征在于： 所述 步骤三中的滚环扩增反应中， 所用的DNA聚合酶是Bst  DNA聚合酶。 6.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病 毒S基因点突变的核酸探针的方法， 其特 征在于： 所述步骤四中检测扩增产物是利用CRISPR/Cas技术检测扩增产物， 所用Cas核酸 酶 是Cas12b。 7.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病 毒S基因点突变的核酸探针的方法， 其特 征在于： 所述步骤二中的连接 反应混合液， 包括DNA连接酶、 RNA模板、 锁式探针、 反应缓冲液 和去离子水。 8.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病 毒S基因点突变的核酸探针的方法， 其特 征在于： 所述步骤三中滚环扩增反应的混合液， 包括DNA聚合 酶、 步骤二所得的产 物、 扩增引 物对、 反应缓冲液和去离 子水。 9.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病 毒S基因点突变的核酸探针的方法， 其特 征在于： 所述步骤二中的连接反应 混合液中， 引物的工作浓度是0.5 ‑10nmol/L； 所述步骤二 中的连接反应条件为25℃， 15 ‑60min。 10.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法， 其 特征在于： 所述 步骤三中的滚环扩增反应条件为5 0‑65℃， 15‑60min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094163 A 2一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物化学与分子生物学领域， 具体为一组快速检测新冠病毒S基因点 突变的核酸探针及方法。 背景技术 [0002]新冠病毒属于单链正义RNA病毒， 在复制过程中十分容易发生突变。 目前世界卫生 组织认定需要关注的变异毒株有 “阿尔法”  (Alpha)、“贝塔”(Beta)、 伽玛 ”(Gamma)、“德尔 塔”(Delta)和 “奥密克戎 ”(Omicron)等。 这些突变株与新冠病毒原始毒株相比， 传染性和毒 性都发生了很大改变。 奥密克戎(Omicr on)突变株是目前突变最多、 最传染力最强的新冠病 毒变异株， 其刺突蛋白(S蛋 白)至少包含32个突变位点， 其中， H655Y、 N679K和P681H突变会 增强刺突蛋白的切割和与宿主细胞的融合， 可能与传播性增加有关； 如何在病毒核酸检测 时快速区分这些突变位 点， 一直是研究者关注的重要问题。 [0003]新冠病毒的遗传物质为单链RNA， 相对双链D NA而言更加不稳定， 当采样、 核酸提取 和保存过程中操作不当， 或存在核酸酶、 酸、 碱等物质时， 很容 易降解， 断裂为小片段。 [0004]目前主流的核酸点突变检测手段包括探针法荧光定量PCR和测序法。 测序法最为 准确， 但耗时较长， 不利于临床快速检测； 探针法荧光定量PCR检测RNA病毒上的点突变， 首 先需要将病毒RNA逆转录为cDNA， 然后使用一对根据突变位点上下游设计的PCR引物， 以及 一条覆盖突变位点的T aqman‑MGB荧光探针进行荧光定量PCR； 由于Taqman探针需要设计在 两条引物之间， 探针法荧光定量PCR需要的模板长度一般不低于100nt， 如果病毒核酸在提 取和保存过程中受到破坏， 碎片化 程度较严重， 则难以检测。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针， 包括检测 新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP ‑1， 超分支滚环扩增引物组RCA ‑F和RCA‑R以及检 测扩增产物所用  sgRNA， 所述检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP ‑1， 超分支滚环 扩增引物组RCA ‑F和RCA‑R均为单链DNA； 所述锁式探针PLP ‑1的核苷酸碱基序列为SEQ  ID  No.1所示， 其中5 ’端具备磷酸化修饰； 所述超分支滚环扩增引物组包含2条引物， 核苷酸碱 基序列分别为 为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。 [0006]作为本发明的一种优选技术方案， 所述检测扩增产物所用sgRNA  的核苷酸碱基序 列为SEQ ID No.4。 [0007]一组快速检测新冠病毒S基因点 突变的核酸探针的方法， 具体步骤如下： [0008]步骤一： 获取病毒RNA； [0009]步骤二： 以步骤一获取的RNA为模板， 加入锁式探针P LP‑1和连接酶， 配制连接反应 混合液， 进行 连接反应； [0010]步骤三： 使用超分支滚环扩增引物组RCA ‑F和RCA‑R和具备链置换活性的DNA聚合 酶对步骤二的反应产物进行滚环扩增反应；说　明　书 1/3 页 3 CN 115094163 A 3