(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210550983.0 (22)申请日 2022.05.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 115011718 A (43)申请公布日 2022.09.06 (73)专利权人 广东省科 学院微生物研究所 （广 东省微生物分析检测中心） 地址 510070 广东省广州市先烈中路10 0号 大院56号 (72)发明人 张明　王超群　王刚正　李燕祯　 李挺　邓旺秋　 (74)专利代理 机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 专利代理师 朱聪聪　刘明星 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 113502344 A,2021.10.15 By Eiji NAGASAW 等.A New Species of Boletus Sect. Bo letus from Japan. 《Proc. Japan Acad》 .19 94,第70卷第10 -15页. Gang Wu等.Four new genera of the fungal family Boletaceae. 《Fung al Diversity》 .2015,第1-24页. 丁小维等.中国有 毒牛肝菌 研究进展. 《安徽 农业科学》 .2010,第38卷(第3期),第1 114-1115 页. 审查员 邓雪霞 (54)发明名称 一种鉴别有毒新牛肝菌的特征性核苷酸序 列、 核酸分子 探针和方法 (57)摘要 本发明公开了一种鉴别有毒新牛肝菌的特 征性核苷酸序列、 核酸分子探针和方法， 属于分 子检测鉴定领域。 本发明提供了一种用于快速鉴 别有毒新牛肝菌的核酸分子探针DNG3F： 5` ‑ TCCTTTCCGTCGACCCTTCT ‑3`； DNG3R： 5` ‑ CGCAAGGTGCGTTCAAAGAT ‑3`以及包含该核酸分子 探针的试剂盒， 还提供了鉴别有毒新牛肝菌的特 征性核苷酸序列(SEQ  IDNO.1)。 以本发明DNG3F 和DNG3R作为引物， 对多种牛肝菌的基因组DNA为 模板， 按照常规PCR方法进行PCR， 结果表明本发 明的核酸分子探针DNG3F和DNG3R具有极高的专 一性， 可以用于快速检测鉴定有毒新牛肝菌子实 体及其相关产品。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 115011718 B 2022.12.13 CN 115011718 B 1.核酸分子探针在制备用于鉴别有毒新牛肝菌 （ Neoboletus  venenatus ） 的试剂盒中 的应用， 其特 征在于， 所述的核酸分子 探针为： DNG3F： 5` ‑TCCTTTCCGTCGACCCTTCT‑3`； DNG3R： 5` ‑CGCAAGGTGCGTTCAAAGAT‑3`。 2.一种有毒新牛肝菌 （ Neoboletus  venenatus ） 的快速鉴定试剂盒， 其特征在于， 包括 权利要求1中的核酸分子探针， 还包括引物ITS1： 5` ‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG ‑3`和ITS4： 5` ‑ TCCTCCGCTTATTGATATGC ‑3`， 作为鉴定有毒新牛肝菌的阳性对照。 3.一种快速鉴别有毒新牛肝菌 （ Neoboletus  venenatus ） 的方法， 其特征在于， 是采用 权利要求1中的核酸分子探针DNG3F和DNG3R作为PCR引物， 以待测样品的基因组DNA为模板 DNA， 进行PCR反应， 检测有PCR产物的则鉴定为待测样品含有 毒新牛肝菌 。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 同时以ITS1： 5` ‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG ‑3` 和ITS4： 5` ‑TCCTCCGCTTATTGATATGC ‑3`为引物对待测样品进行PCR反应， 作为鉴定有毒 新牛 肝菌的阳性对照。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR反应， 其反应体系为25μL总体 积： ddH2O 9.5 μL， PCR ‑Mix 12.5 μL， 引物DNG3F  10 μmol/L 1μL， 引物DNG3R  10 μmol/L 1μ L， 模板DNA  1 μL。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR反应， 其反应程序为94℃  5min 预变性； 94℃  30s， 60℃ 30s， 72℃ 60s， 30个循环； 72℃  8min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011718 B 2一种鉴别有毒新牛肝菌的特征性核 苷酸序列、 核酸分子探针 和方法 技术领域： [0001]本发明属于分子检测鉴定领域， 具体涉及 一种鉴别有毒新牛肝菌的特征性核苷酸 序列、 核酸分子 探针和方法。 背景技术： [0002]大型真菌是指能形成大型子实体的， 肉眼可见、 徒手可摘的一类真菌， 广义上泛指 蘑菇。 大型真菌是一类重要的生物资源， 很多种类具有较高的营养价值和药用价值， 是菌物 中最有开发应用前景的一类， 根据其用途可分为食用菌、 药用菌和毒菌。 食用菌因具有高蛋 白、 低脂肪， 含有丰富的氨基酸， 营养价值高等特点， 被广大消费者所青睐。 尤其是一些珍稀 的野生食用菌， 如块菌、 鸡油菌、 牛肝菌、 松 茸等， 更被视为山中珍品。 近些年， 随着人们生活 水平的不断提高， 对饮食的追求不断增加， 使得越来越多的人加入到食用野生菌的行列中， 野生菌交易应运而生。 由于大部分采食者缺 乏对野生菌的认识， 常常导致一些有毒的野生 菌出现在 食客的餐桌上， 因误食野生菌中毒的事件频繁发生， 并且常常引起严重后果， 甚至 导致死亡。 [0003]有毒新牛肝菌Neoboletus  venenatus(Nagas.)G.Wu&Zhu  L.Yang， 隶属于牛肝菌 目Boletales， 牛肝菌科Boletaceae， 新牛肝菌属Neoboletus， 是原描述于日本的一个东亚 分布牛肝菌物种， 因其子实体较大， 与美味牛肝菌Boletus  edulis Bull.在外观形态上较 为相似， 因此常被当做美味牛肝菌采食， 误食后会引起严重的胃肠炎和神经型中毒症状， 严 重者可导致昏迷。 近年来， 在广东、 上海等地区频繁发生因误食有毒新牛肝菌导致的中毒事 件， 因此， 开 发一种快速准确地鉴别有毒新牛肝菌的方法和技术， 对误食有毒新牛肝菌中毒 快速检测与救治具有重要作用。 [0004]DNA是生物遗传信息的载体， 每种物种乃 至个体均具有独特的核苷酸序列， 且具有 遗传稳定性， 不会受到环境或培养条件的影响， 是鉴别生物物种或个体重要且可靠的分子 标记。 利用分子生物学技术手段对物种或个体的特异性序列进行分析研究， 对供试样本的 特征性核苷酸序列进 行扩增， 可快速准确地对该样本进 行鉴别。 目前， 该技术方法已应用于 鹅膏， 虫草等大型真菌的物种鉴定中， 但尚未见有关于有有毒新牛肝菌鉴定相关的核苷酸 特征性序列的报道。 发明内容： [0005]为解决上述问题， 本发明提供一种快速鉴别有毒新牛肝菌 的特征性核苷酸序列、 核酸分子 探针和方法。 [0006]本发明的第一个目的是提供一种用于快速鉴别有毒新牛肝菌的核酸分子探针， 所 述核酸分子 探针为： [0007]DNG3F： 5` ‑TCCTTTCCGTCGACCCTTCT‑3`； [0008]DNG3R： 5` ‑CGCAAGGTGCGTTCAAAGAT‑3`。说　明　书 1/4 页 3 CN 115011718 B 3