(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210551572.3 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 中国农业大 学 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 汪超子　刘家荣　郭麟熙　梁承鹏　 刘耿　霍再林　牛俊　胡曾杰　 袁曜　王钰浩　谢恩　焦健　赵枭　 法科宇　张煜涵　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 黄爽 (51)Int.Cl. G01V 15/00(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 高恢复率的未包裹DNA土壤水示踪剂及制备 方法 (57)摘要 本发明提供一种高恢复率的未包裹DNA土壤 水示踪剂， 所述示踪剂的组成如下： 0.1 ‑20μ mol/L长度为80 ‑120bp的单链DNA， 0.01 ‑0.2mol/ L Tris， 0.001 ‑0.2mol/LEDTA， 0.3 ‑1mol/L磷酸 一氢钠或0.05 ‑0.1mol/L六偏磷酸钠溶液， 0.2 ‑ 0.8g/L亮蓝， 并用5 ‑6mol/L NaOH或5 ‑6mol/L  HCl调pH至 7.0‑9.0。 穿透饱和土柱的恢复率实验 表明， 本发明未包裹DNA土壤水示踪剂与已有的 DNA示踪剂相比， 具有在真实土壤中不易 分解、 不 易吸附、 穿透率更高的优势。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 114966890 A 2022.08.30 CN 114966890 A 1.高恢复率的未包裹DNA土壤水示踪剂， 其特征在于， 所述示踪剂的组成如 下： 0.1‑20 μ mol/L长度为80 ‑120bp的单链DNA， 0.01 ‑0.2mol/L  Tris， 0.001 ‑0.2mol/L  EDTA， 0.3 ‑1mol/ L磷酸一氢钠， 0.2 ‑0.8g/L亮蓝， 并用NaOH或H Cl溶液调pH至7.0‑9.0； 优选地， 所述示踪剂的组成如下： 0.2μmol/L长度为80 ‑120bp的单链DNA， 0.1mol/L   Tris， 0.1mol/L  EDTA， 0.5mol/L磷酸一氢钠， 0.8g/L亮蓝， 并用5 ‑6mol/L NaOH或5‑6mol/L  HCl调pH至7.0‑9.0。 2.根据权利要求1所述的示踪剂， 其特征在于， 所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:1所示。 3.权利要求1或2所述示踪剂的制备方法， 其特征在于， 合成的单链DNA经HPLC纯化后， 与预先配制的含Tris、 EDTA、 磷酸 一氢钠、 亮蓝的溶 液按比例混合， 最后用NaOH溶 液调pH。 4.高恢复率的未包裹DNA土壤水示踪剂， 其特征在于， 所述示踪剂的组成如 下： 0.1‑20 μ mol/L长度为80 ‑120bp的单链DNA， 0.01 ‑0.2mol/L  Tris， 0.001 ‑0.2mol/L  EDTA， 0.05 ‑ 0.1mol/L六偏磷酸钠溶 液， 0.2‑0.8g/L亮蓝， 并用NaOH或H Cl溶液调pH至7.0‑9.0； 优选地， 所述示踪剂的组成如下： 0.2μmol/L长度为80 ‑120bp的单链DNA， 0.1mol/L   Tris， 0.1mol/L  EDTA， 0.1mol/L六偏磷酸钠溶液， 0.8g/L亮蓝， 并用5 ‑6mol/L NaOH或5‑ 6mol/L HCl调pH至7.0‑9.0。 5.根据权利要求4所述的示踪剂， 其特征在于， 所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:1所示。 6.权利要求4或5所述示踪剂的制备方法， 其特征在于， 合成的单链DNA经HPLC纯化后， 与预先配制的含Tris、 EDTA、 六偏磷酸钠、 亮蓝的溶 液按比例混合， 最后用NaOH溶 液调pH。 7.权利要求1、 2、 4或5任一项所述 示踪剂在土壤环境 示踪中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 预先测试土壤pH， 将所述示踪剂的pH调至 土壤pH后使用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 土壤pH为8.0 。 10.根据权利要求7 ‑9任一项所述的应用， 其特征在于， 所述示踪剂的投入量为土壤总 孔隙体积的10％ ‑20％。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114966890 A 2高恢复率的未包裹DNA土壤水示踪剂及制备方 法 技术领域 [0001]本发明属于环境保护领域， 具体地说， 涉及一种高恢复率的未包裹DNA土壤水示踪 剂及制备 方法。 背景技术 [0002]DNA示踪剂理论上可以是任意序列， 且人工合成的D NA在合成时可以确保其序列在 环境中背景值为零， 免受环境中其他试验或其他DNA的影 响。 因此， 人工合 成的DNA示踪剂因 其可编码性、 特异 性、 不受环境背景值影响， 对环境无污染的优势成为一种新兴的水土环 境 示踪剂。 [0003]未包裹DNA在环境中易分解， 在土壤中的半衰期只有几天， 且容易被土壤颗粒吸 附， 恢复率低。 在砂柱实验中， 随着DNA长度的增加， DNA 示踪剂穿透曲线的峰值高度/恢复率 呈下降趋势， 且DNA 示踪剂的恢复率通常比保守示踪剂低2 ‑4个数量级。 近年来， 兴起了利用 PLGA、 PLA、 SiO2等材料包裹D NA的新技术， 尽管包裹后的DNA示踪剂不易被分解， 在示踪地表 水、 污染物排放过程中得到较好的应用， 但包裹后的DNA示踪剂粒径更大， 难以穿透土壤孔 隙， 示踪剂恢复率低， 不宜在水土环境中应用。 目前尚未有学者从改进未包裹DNA示踪剂配 方方面提高DNA的恢复率。 [0004]目前， 未包裹DNA示踪剂和包裹 的DNA示踪剂应用于不同水土环境各有不足。 未包 裹DNA示踪剂易分解、 易吸附， 在真实土壤中穿透率低。 而包裹的DNA示踪剂粒径大， 易被土 壤过滤， 在土壤中穿透率更低。 因此， 亟需开发一种新型的土壤水示踪剂。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种高恢复率的未包裹DNA土壤水示踪剂及制备 方法。 [0006]为了实现本发明目的， 第一方面， 本 发明提供一种高恢复率的未包裹DNA土壤水示 踪剂(示踪剂I)， 所述示踪剂的组成如下： 0.1 ‑20 μmol/L长度为80 ‑120bp的单链DNA， 0.01 ‑ 0.2mol/L  Tris， 0.001 ‑0.2mol/L  EDTA， 0.3 ‑1mol/L磷酸一氢钠， 0.2 ‑0.8g/L亮蓝， 并用 NaOH或HCl溶液调pH至7.0‑9.0。 [0007]优选地， 所述示踪剂的组成如下： 0.2 μmol/L长度为8 0‑120bp的单链DNA， 0.1mol/L   Tris， 0.1mol/L  EDTA， 0.5mol/L磷酸一氢钠， 0.8g/L亮蓝， 并用5 ‑6mol/L NaOH或5‑6mol/L  HCl调pH至7.0‑9.0。 [0008]在本发明的一个具体 实施方式中， 本发明所述单链DNA为88bp的单链T12DNA， 其核 苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 [0009]本发明还提供所述示踪剂I 的制备方法， 合成的单链DNA经HPLC纯化后， 与预先配 制的含Tris、 EDTA、 磷酸 一氢钠、 亮蓝的溶 液按比例混合， 最后用NaOH或H Cl溶液调pH。 [0010]进一步地， 所述示踪剂I中， 含Tris、 EDTA、 磷酸一氢钠、 亮蓝的溶液配制方法为： 称 取Tris粉末 1.2138g、 EDTA粉末2.9371g、 磷酸一氢钠粉末 18.0879g、 亮蓝粉末0.5 g， 搅拌溶 解后用5mo l/L NaOH溶液调pH至8.0后定容至10 0mL。说　明　书 1/5 页 3 CN 114966890 A 3