(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210548197.7 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 昆明理工大 学 地址 650500 云南省昆明市呈贡新区景明 南路727号 (72)发明人 张阿梅　刘妮　夏雪山　郑克溪　 (74)专利代理 机构 北京众泽信达知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11701 专利代理师 张艳萍 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) G01N 33/569(2006.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种micorRNA 206抑制HCV增殖的建立方法 (57)摘要 本发明属于基因工程技术领域， 公开了一种 micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法， 预先合成 带有CY5基团的miR ‑206模拟物， 确定最佳 感染复 数与转染量， 并通过激光共聚焦与qRT ‑PCR分别 检测miR‑206的转染 效率以及 表达量； 验证HCV病 毒感染12h后， 过表达miR ‑206对HCV病毒增殖的 抑制作用。 本发明提供miR ‑206转染入细胞过表 达， 并通过荧光定量PCR检测miR ‑206相对表达 量， 通过评估HCV的病毒载量及其蛋白表达量分 析microRNA ‑206的抑制效果。 本发明建立了检测 miR‑206抑制HCV增殖的检测方法。 该方法的建立 为生物药物抑制H CV增殖的检测提供了新方向。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 114990159 A 2022.09.02 CN 114990159 A 1.一种micorRNA206抑制 HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述micorRNA206抑制HCV 增殖的建立方法包括： miR‑206转染入细胞过表达， 通过荧光定量PCR检测miR ‑206相对表达量， 并通过评估 HCV的病毒载量及蛋白表达量分析microRNA ‑206的抑制效果。 2.如权利要求1所述的micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述 micorRNA 206抑制HCV增殖的建立方法还 包括： 预先合成带有CY5基团的miR ‑206模拟物， 确定最佳感染复数与转染量， 并通过激光共 聚焦与qRT ‑PCR分别检测miR ‑206的转染效率以及表达量； 验证HCV病毒感染12h后， 过表达 miR‑206对HCV病毒增殖的抑制作用。 3.如权利要求1所述的micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述HCV病 毒载量检测引物序列为SEQ  ID NO： 1和SEQ  ID NO： 2， 探针序列为SEQ  ID NO： 3。 4.如权利要求1所述的micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述检测 miR‑206表达量引物的序列为SEQ  ID NO： 4和SEQ  ID NO： 5。 5.如权利要求1所述的micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述 micorRNA 206抑制HCV增殖的建立方法包括以下步骤： 步骤一， 确定 HCV对细胞的感染复数； 步骤二， 转染试剂用量与miR ‑206转染浓度的确定； 步骤三， miR ‑206表达量的检测； 步骤四， H CV病毒载量及蛋白的检测。 6.如权利要求5所述的micor RNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述步骤一 中， 设置不同感染复数对细胞进行感染， 在感染12h后， 通过间接免疫荧光确定HCV感染复 数。 7.如权利要求6所述的micor RNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述感染复 数MOI＝0.1、 0.3、 1、 2、 3 。 8.如权利要求5所述的micor RNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述步骤二 中， 设置不同转染试剂LipofectamienTM  3000与miR ‑206mimics用量， 在转染24h后通过 qPCR检测miR ‑206表达情况， 确定转染试剂与miR ‑206mimics的最佳用量。 9.如权利要求8所述的micor RNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 所述不同转 染试剂LipofectamienTM  3000的体积依次为0.75 μL、 1.5 μL和3 μL； 20nM  miR‑206mimics转 染体积为0.5 μL、 1.5 μL和2.5 μL。 10.如权利要求5所述micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法， 其特征在于， 通过CCK ‑8试 剂盒检测H CV病毒感染与转染miR ‑206mimics对细胞活性的影响。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990159 A 2一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方 法 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 尤其涉及一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方 法。 背景技术 [0002]目前， 丙型肝炎病毒(hepatitis  C virus， HCV)感染是引起世界范围慢性病毒性 肝病的主要病因之一， 其引起的丙型肝炎最终可导致肝硬化甚至肝细胞癌。 由于目前尚缺 乏HCV的疫苗， 且其具体的致病机制尚未被完全阐明。 研究表明宿 主因素与HCV的感染、 致病 过程及患者治疗效果有密切关系， 因此对其进行研究将有助于HCV感染的预防和个体化治 疗。 [0003]microRNA(miRNA)是一类内源性非编 码小分子RNA， 具有调控细胞分化、 增殖、 凋亡 和代谢等多种生物学功能， 同时参与感染性疾病、 代谢性疾病及肿瘤等多种疾病的发生过 程。 miRNA通过结合靶 标基因的非编码区来抑制mRNA的翻译 过程或降解mRNA， 进而调控转录 后基因表达过程。 近年 来， 越来越多的miRNA被 证实与HCV的感染密切相关。 [0004]microRNA‑206(miR‑206)位于人类6号 染色体上， 在脊椎动物中高度保守。 miR ‑206 首次按在骨骼肌中被发现， 并被认为是骨骼肌特异性表达micr oRNA。 随后， 在心脏、 肺、 脑和 肝脏等组织中也 发现miR‑206的表达， 并且参与到这些器官的生理和病理反应过程中。 目前 为止， miR‑206已被证实与乳 腺癌、 结肠癌、 横纹肌肉瘤等肿瘤的发生具有相关性。 最近发现 在肝细胞癌的患者中miR ‑206的表达量明显低于正常人， 并且其表达量与肝癌细胞的分化 程度、 癌细胞的结节数量、 淋巴结转移以及肝癌的进展等相关， 体外实验证实miR ‑206可以 减少肝癌细胞的增殖、 浸润和转移速度， 并能加速其凋亡， 但是具体的致病机制尚未完全阐 明。 目前对于miR ‑206与肝细胞癌的研究较少， 部分研 究证实miR ‑206在肝组织代谢过程中 发挥重要作用， 但尚未 见miR‑206与HCV复制增殖的相关报道。 [0005]通过上述分析， 现有技 术存在的问题及缺陷为： [0006](1)由于目前尚缺乏H CV的疫苗， 且其具体的致病机制尚未被完全阐明。 [0007](2)尚未见miR‑206与HCV复制增殖的相关报道， 其可能是潜在的H CV治疗药物。 发明内容 [0008]针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种micorRNA206抑制HCV增殖的实验方 法及检测方法。 [0009]本发明所述micorRNA 206抑制HCV增殖方法和检测方法的建立包括： [0010]miR‑206转染入HCV感染的细胞过表达， 通过荧光定量PCR检测miR ‑206相对表达 量， 并通过评估H CV的病毒载量及蛋白表达量分析microRNA ‑206的抑制效果。 [0011]进一步， 所述micorRNA 206抑制HCV增殖的建立方法还 包括： [0012]预先合成带有CY5基 团的miR‑206模拟物， 确定最佳感染复数与转染量， 并通过激 光共聚焦与qRT ‑PCR分别检测miR ‑206的转染效率以及表达量； 验证HCV病毒感染12h后， 过说　明　书 1/7 页 3 CN 114990159 A 3