(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210552056.2 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 中国农业大 学 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 汪超子　郭麟熙　刘家荣　梁承鹏　 刘耿　霍再林　牛俊　胡曾杰　 袁曜　王钰浩　谢恩　焦健　赵枭　 法科宇　张煜涵　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 黄爽 (51)Int.Cl. G01V 15/00(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 未包裹DNA土 壤水示踪剂及制备方法 (57)摘要 本发明提供一种未包裹DNA土壤水示踪剂， 所述示踪剂的组成如下： 0.1 ‑20μmol/L长度为 80‑120bp的未包裹单链DNA， 0.01 ‑0.2mol/L   Tris， 0.001 ‑0.2mol/LEDTA， 0.2 ‑0.8g/L亮蓝， 并 用5‑6mol/L NaOH或5‑6mol/L HCl溶液调pH至 7.0‑9.0。 穿透饱和土柱的恢复率实验表明， 本发 明未包裹DNA土壤水示踪剂与已有的DNA示踪剂 相比， 具有在真实土壤中不易分解、 不易吸附、 穿 透率更高的优势。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图4页 CN 114966891 A 2022.08.30 CN 114966891 A 1.未包裹DNA土壤水示踪剂， 其特征在于， 所述示踪剂的组成如下： 0.1 ‑20μmol/L长度 为80‑120bp的单链DNA， 0.01 ‑0.2mol/L  Tris， 0.001 ‑0.2mol/L  EDTA， 0.2 ‑0.8g/L亮蓝， 并 用NaOH或H Cl溶液调pH至7.0‑9.0。 2.根据权利要求1所述的示踪剂， 其特征在于， 所述示踪剂的组成如 下： 0.2 μmol/L长度 为80‑120bp的单链DNA， 0.1mol/L  Tris， 0.1mol/L  EDTA， 0.5g/L亮蓝， 并用5 ‑6mol/L NaOH 或5‑6mol/L HCl溶液调pH至7.0‑9.0。 3.根据权利要求1或2所述的示踪剂， 其特征在于， 所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:1所示。 4.权利要求1 ‑3任一项所述示踪剂的制备方法， 其特征在于， 合成的单链DNA经HPLC纯 化后， 与预 先配制的含Tris、 EDTA、 亮蓝的溶 液按比例混合， 最后用NaOH溶 液调pH。 5.权利要求1 ‑3任一项所述 示踪剂在土壤环境 示踪中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 预先测试土壤pH， 将所述示踪剂的pH调至 土壤pH后使用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， 土壤pH为8.0 。 8.根据权利要求5 ‑7任一项所述的应用， 其特征在于， 所述示踪剂的投入量为土壤总孔 隙体积的10％ ‑20％。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114966891 A 2未包裹DNA土壤水示踪剂及制备方 法 技术领域 [0001]本发明属于环境保护领域， 具体地说， 涉及一种未包裹D NA土壤水示踪剂及制备方 法。 背景技术 [0002]DNA示踪剂理论上可以是任意序列， 且人工合成的D NA在合成时可以确保其序列在 环境中背景值为零， 免受环境中其他试验或其他DNA的影 响。 因此， 人工合 成的DNA示踪剂因 其可编码性、 特异 性、 不受环境背景值影响， 对环境无污染的优势成为一种新兴的水土环 境 示踪剂。 [0003]未包裹DNA在环境中易分解， 在土壤中的半衰期只有几天， 且容易被土壤颗粒吸 附， 恢复率低。 在砂柱实验中， 随着DNA长度的增加， DNA 示踪剂穿透曲线的峰值高度/恢复率 呈下降趋势， 且DNA 示踪剂的恢复率通常比保守示踪剂低2 ‑4个数量级。 近年来， 兴起了利用 PLGA、 PLA、 SiO2等材料包裹D NA的新技术， 尽管包裹后的DNA示踪剂不易被分解， 在示踪地表 水、 污染物排放过程中得到较好的应用， 但包裹后的DNA示踪剂粒径更大， 难以穿透土壤孔 隙， 示踪剂恢复率低， 不宜在水土环境中应用。 目前尚未从改进未包裹DNA示踪剂配方方面 提高DNA恢复率的相关研究报道。 [0004]目前， 未包裹DNA示踪剂和包裹 的DNA示踪剂应用于不同水土环境各有不足。 未包 裹DNA示踪剂易分解、 易吸附， 在真实土壤中穿透率低。 而包裹的DNA示踪剂粒径大， 易被土 壤过滤， 在土壤中穿透率更低。 因此， 亟需开发一种新型的土壤水示踪剂。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种未包裹DNA土壤水示踪剂及制备 方法。 [0006]为了实现本发明目的， 本发明提供一种未包裹D NA土壤水示踪剂， 所述示踪剂的组 成如下： 0.1 ‑20 μmol/L长度为80 ‑120bp的单链DNA， 0.01 ‑0.2mol/L  Tris， 0.001 ‑0.2mol/L   EDTA， 0.2 ‑0.8g/L亮蓝， 并用NaOH或H Cl溶液调pH至7.0‑9.0。 [0007]优选地， 所述示踪剂的组成如下： 0.2 μmol/L长度为8 0‑120bp的单链DNA， 0.1mol/L   Tris， 0.1mol/L  EDTA， 0.5g/L亮蓝， 并用5 ‑6mol/L NaOH或5‑6mol/L HCl溶液调pH至7.0 ‑ 9.0。 [0008]在本发明的一个具体实施方式中， 所述单链DNA为88bp的单链T12  DNA， 其核苷酸 序列如SEQ  ID NO:1所示。 [0009]本发明还提供所述示踪剂的制备方法， 合成的单链D NA经HPLC纯化后， 与预先配制 的含Tris、 EDTA、 亮蓝的溶 液按比例混合， 最后用NaOH溶 液调pH。 [0010]本发明示踪剂的设计原理如下： (1)pH8.0为DNA最佳储存酸碱度， 在pH3.0 ‑9.0范 围内， 随着示踪剂pH增加， 土壤对DNA的吸附量有明显减少， 因此， pH8.0为适宜DNA保存、 吸 附量较少、 与中国北方土壤pH(7.0 ‑9.0)最接近的折中示踪剂酸碱度； (2)Tris缓冲溶液具 有稳定示踪剂体系pH的作用， 可以使DNA处于pH8.0的最佳储存酸碱度。 EDTA可以螯合二价说　明　书 1/4 页 3 CN 114966891 A 3