(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210542989.3 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 中国计量大 学 地址 310000 浙江省杭州市下沙高教园区 学源街258号 (72)发明人 伍义行　张彤彤　朱羽婕　廉润通　 叶子弘　俞晓平　马爱进　赵同标　 (74)专利代理 机构 杭州五洲普华专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 33260 专利代理师 姚宇吉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种细胞交叉污染检测方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种细胞交叉污染检测方法， 包括如下步骤： S1： 制备细胞交叉污染样本， 并进 行细胞DNA提取； S2： 根据位点信息设计引物建立 多重PCR扩增体系； S3： 文库 构建成功后进行高通 量测序分析； S4： 按照判定标准， 确认细胞是否存 在交叉污染。 本发明通过高通量测序技术对微单 倍型进行分析， 能够获得微单倍型复合体系中 SNP位点的全部基因分型， 具有速度快、 准确可靠 性高、 集成化等优点。 本发明可适用于细胞制剂 的质量控制和细胞库对 储存细胞系质量的监测。 权利要求书1页 说明书18页 附图3页 CN 114717337 A 2022.07.08 CN 114717337 A 1.一种细胞交叉污染检测方法， 其特 征在于包括如下步骤： S1： 制备细胞交叉污染样本， 并进行细胞DNA提取； S2： 根据位 点信息设计引物建立多重PCR扩增体系； S3： 文库构建成功后进行高通 量测序分析； S4： 按照判定标准， 确认细胞 是否存在交叉污染。 2.根据权利 要求1所述的一种细胞交叉污染检测方法， 其特征在于： 步骤S2中， 在131个 微单倍型位点上拆分成172个扩增片段， 每个扩增片段均包括一个正向引物和一个反向引 物， 正向引物和反向引物的序列为SEQ  ID No.1‑SEQ ID No.344。 3.根据权利要求2所述的一种细胞交叉污染检测方法， 其特征在于： 步骤S2中， 共进行 两轮PCR反应， 第1轮多重PCR反应 分为2个反应管进行， 第1轮PCR扩增后， 将2 个反应管的PCR 产物合并， 经磁珠纯化后， 进行第2轮多重PCR反应； 取第2轮多重PCR反应产物磁珠纯化后， 吸取上清液， 并将其 转移到新的PCR管中， 即为制备的多重PCR文库。 4.根据权利要求1所述的一种细胞交叉污染检测方法， 其特征在于： 已知单一细胞样本 测序分型结果， 步骤S4的结果判定标准如下： 与单一细胞样 本分型结果比较， 若检测到单一 细胞样本不存在的基因型， 即可判断培 养细胞存在 细胞交叉污染。 5.根据权利要求1所述的一种细胞交叉污染检测方法， 其特征在于： 未知单一细胞样本 测序分型结果， 步骤S4的结果判定标准如下： 至少两个基因座出现三个及三个以上等位基 因时， 或者该检测体系中两个以上扩增片段出现多于3个基因型， 即可判断培养细胞存在细 胞交叉污染。 6.权利要求1 ‑5所述的任意一种细胞交叉污染检测方法， 在细胞制剂的质量控制中的 应用。 7.权利要求1 ‑5所述的任意一种细胞交叉污染检测方法， 在细胞库对储存细胞系质量 的监测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717337 A 2一种细胞 交叉污染检测方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物医药技 术领域， 尤其涉及一种细胞交叉污染检测方法及应用。 背景技术 [0002]细胞交叉污染(cell cross ‑contamination)是指细胞在分离、 培养和使用过程 中， 混入了来源于种属内或种属外的非目标细胞而造成的污染。 1952年第一株人源细胞系 HeLa细胞系被成功建立， 从此细胞培养成为生物医药产业发展不可或缺的工具。 伴随着细 胞培养的广泛应用， 细胞错误鉴定或培养物交叉污染逐渐成为一个长期困扰的问题。 据 统 计全球广泛使用的细胞系中有超过400种细胞系经证实被错误鉴定或交叉污染， 在美国、 欧 洲和亚洲等 实验室中至少有20％存储的细胞系被错误鉴定或交叉污染。 2016年中 国科学院 昆明细胞库公布在其储存的细胞中发现61种错误鉴定和污染的细胞系。 经国家 生物医学实 验细胞资源库检测， 截止2020年3月， 共发现107种错误细胞系， 其中47种属于 建系过程中被 污染。 而对来自中国22个机构的278种细胞系进行检测， 发现有46％的细胞系(128/278)被 错误鉴定/交叉污染， 其中由中国研究者建立的细胞系中有73.2％(52/71) 被错误鉴定。 交 叉污染或细胞系身份错误识别而导致的研究结论错误问题， 对科研以及生产、 临床应用等 造成了严重危害。 因此， 确保细胞系身份 真实且不存在交叉污染， 是生产用细胞基质以及治 疗用细胞产品的关键质控指标。 原国家卫生与计划 生育委员会、 原国家食品药品监督管理 总局于2015年发布的 《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》 和2017年发布 的 《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》 ， 也明确指出 临床用细胞或细胞治疗产 品应进行细胞鉴定， 确定细胞无 交叉污染。 但目前仍缺乏可靠的细胞交叉污染检测体系， 迫 切需要开发具有更高灵敏度和更 具特异性的细胞交叉污染检测新 技术。 [0003]单倍型(haplotype)是指在一条染色体上， 紧密连锁的多个等位基因的线性 组合， 每一种组合方式可视为一种单倍型。 与基因类似， 单倍型是具有统计学关联性的遗传标记， 可由多个单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNP)位点构成， 包含丰富 的遗传信息， 研究单倍型比研究单个SNP位点效果更佳。 2013年Kidd教授首次提出微单倍型 (microhaplotype)概念， 微单倍型的片段长度更短， 200bp范围内可包含2～4个SNP。 微单 倍型是由SNP线性排列而成， 但它具有其独特性， 并克服了SNP的缺点， 具体表现在： 高度多 态性、 较低突变率、 检测方法背景影响小、 适用于混合样本和降解样本检测、 序列跨度小且 长度均衡， 能较大程度避免扩增不平衡问题。 作为一种新型遗传标记， 微单倍型为祖源推 断、 个体识别及亲子鉴定、 法医学以及遗传学相关研究等领域 提供了一种新的选择。 [0004]目前， 细胞交叉污染的检测方法包括细胞形态学特征分析、 染色体核型分析、 同工 酶谱分析、 人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分型、 基于DNA保守序列的 PCR种属鉴定法、 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)分析、 短串联 重复序列(short tandem repeat， STR)分析等。 2011年美国ATCC发布了基于STR 分型的人 源细胞系鉴定标准 《Authentication of Human Cell Lines: Standardization of STR Profiling》 。 2015年美国发布了基于线粒体CO1 DNA条形码的动物细胞种属鉴定标准说　明　书 1/18 页 3 CN 114717337 A 3