(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210535332.4 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 山东大学齐鲁医院 地址 250012 山东省济南市历下区文化西 路107号 (72)发明人 王凯　魏雪菲　刘慧慧　范玉琛　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 专利代理师 宋海海 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 TL1A作为生物标志物在肝硬化诊断中的应 用 (57)摘要 本发明属于属于生物医学技术领域， 具体提 供TL1A作为生物标志物在肝硬化诊断中的应用。 本发明通过研究首次发现TL1A基因启动子在乙 肝相关肝硬化患者中呈现低甲基化状态， 提示 TL1A基因启 动子的甲基化程度与乙肝相关肝硬 化患者的诊断密切相关， 因此对TL1A 基因启动子 的甲基化进行定量检测可以提示乙肝相关肝硬 化的发生发展， 从而辅助临床诊断， 因此具有良 好的实际应用之价 值。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 114891877 A 2022.08.12 CN 114891877 A 1.一种检测肿瘤坏死因子配体相关分子1A基因甲基化程度的物质在制备肝硬化诊断 或辅助诊断产品中的应用。 2.如权利要求1所述应用， 其特征在于， 所述肿瘤坏死因子配体相关分子1A基因选自受 试者血液； 所述物质是使用实时定量甲基化特异性PCR检测方法对TL1A基因甲基化程度进行检测 所使用的物质； 所述肝硬化为乙肝相关肝硬化。 3.如权利要求1所述应用， 其特征在于， 所述肝硬化诊断或辅助诊断产品为监测或预测 慢性乙肝患者向乙肝相关肝硬化发展的产品； 所述产品为检测试剂盒。 4.一种检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒至少包括针对目的基因TL1A启动子 的甲基化特异性引物对和Taqman 荧光探针； 具体序列如下： TL1A‑上游引物： 5 ’ATTTAGTTAGGACGTATATAG GTG 3’(SEQ ID NO.1)； TL1A‑下游引物： 5 ’TTTACCAATTTAACAAACCCGAA 3’(SEQ ID NO.2)； TL1A‑Taqman荧光探针： 5 ’CTAAAACCCAAAACAACAAACTCC 3’(SEQ ID NO.3)； 优选的， TL1A ‑Taqman荧光探针在5 ’端和3’端分别设置有荧 光基团和淬灭基团。 5.如权利要求4所述的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒包括内参基因 的特异 性引物对和Taqman 荧光探针。 6.如权利要求5所述的检测试剂盒， 其特 征在于， 所述内参基因为GPADH； 内参基因特异性引物对和Taqman 荧光探针具体序列如下： GPADH‑上游引物： 5 ’TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3’(SEQ ID NO.4)； GPADH‑下游引物： 5 ’AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAAA3’(SEQ ID NO.5)； GPADH‑Taqman荧光探针： 5 ’ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA’(SEQ ID NO.6)； 优选的， GPADH ‑Taqman荧光探针在5 ’端和3’端分别设置有荧 光基团和淬灭基团。 7.如权利要求4所述的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒还包括阳性对照和阴 性对照； 优选的， 所述阳性对照为重亚硫酸盐修饰的10 0％甲基化的人基因 组DNA； 所述阴性对照为水， 优选为高压的双蒸馏水。 8.如权利要求4所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括提取血液(包 括外周血)基因组DNA的试剂， 对基因组DNA进 行重亚硫酸盐修饰的试剂和预混PCR反应体系 液等。 9.一种用于诊断或辅助诊断肝硬化的系统， 其特征在于， 所述系统包括定量检测单元 和分析单元； 其中， 所述定量检测单元包括： 采用权利要求4 ‑8任一项所述检测试剂盒进行实时定量 甲基化特异性聚合酶链式反应； 所述分析单元包括对定量检测单元获得的结果进行分析， 检测待测样本TL1A的DNA甲 基化程度， 判断受试者患病情况。 10.如权利要求9所述系统， 其特 征在于， 所述待测样本是受试者血 液(包括外周血)。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891877 A 2TL1A作为生物标志物在 肝硬化诊断中的应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医学技术领域， 具体涉及TL1A作为生物标志物在肝硬化诊断中的 应用。 背景技术 [0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必然 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 [0003]肝硬化(Liver  corrhosis,LC)是临床上常见的一种慢性进行性肝病， 是由一种或 多种病因长期或反复作用而引起的。 组织病理学显示肝细胞广泛坏死， 残余肝细胞结节性 再生， 结缔组织增生， 纤维间隔形成， 导致肝小叶结构破坏， 假小叶形成。 在我国， 慢性乙型 肝炎(CHB)病毒感染是肝硬化和肝衰竭发展的最重要的危险因素， 晚期以肝功能损害和门 脉高压为主要表现， 累及多系统， 常导致上消化道出血、 肝性脑病、 继发性感染、 脾功能亢 进、 腹水、 癌变等并发症。 但在早期， 由于肝脏代偿功能较强， 未发现明显症状， 多依赖影像 学检查， 必 要时可通过肝活检病理检查 或腹腔镜检查确诊。 因此， LC的早期诊断迫切需要有 效的生物标志物， 及时有效诊断， 延缓病情发展仍是医学难题。 因此， 揭示乙型肝炎相关肝 硬化的机制， 建立有效的综合评估诊断标准， 制订有效的防治方案具有重大意 义。 [0004]研究表明， 表观遗传是指基于 非基因序列改变所致基因表达水平变化， 如D NA甲基 化和染色质构象变化等， 在肝硬化行程中过程中发挥重要作用， 已逐渐成为医学领域的研 究热点。 其中， DNA甲基化是表观遗传学的重要调控机制之一， 所谓DNA甲基化是指在DNA甲 基化转移酶(DNMT)的作用下， 在基因组CpG二核苷 酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基 基团即5‑甲基胞嘧啶。 甲基化胞嘧啶主要位于DNA的长链中， 其中含有高密度的CpG簇， 称为 CpG岛。 而甲基化则主要发生于CpG岛的胞嘧啶上。 基因启动子区的甲基化可抑制转录， 从而 影响细胞/组织特异 性基因的表达。 研究表明， 感染HBV的宿 主均存在DNMT表达上调的现象， 因此， HBV可通过增强DNMT的活性， 促使病毒DNA启动子发生甲基化， 抑制病毒DNA转录， 从而 抑制病毒的复制。 [0005]肝硬化患者其肝脏有不同程度的纤维化改变。 纤维化和炎性损伤在肝硬化的发生 发展过程中发挥重要作用。 肿瘤坏死因子配体相关分子1A(TL1A)是由TNFSF15编码的TNF超 家族蛋白(TNFSF)的成员之一， 是内皮细胞中主要的跨膜蛋白， 在多种慢 性炎症过程中发挥 关键作用， 在肝脏中主要位于巨噬细胞中， 促进分泌一系 列促炎因子和促纤维化因子， 这些 因子可作用于造血干细胞诱导促纤维化表型。 具体来说， 可产生并激活典型 的促纤维化细 胞因子TGF ‑β 1， 其可增加肌成纤维细胞ECM和 TIMP‑1的产生。 此外， 肝巨噬细胞还可以产生 PDGF‑BB(肌成纤维细胞增殖刺激剂)， IL ‑1β和TNF‑α， 以维持促炎促纤维化刺激。 在肝纤维 化中发挥重要作用， 研究表明， TL1A基因甲基化程度与其表达水平间存在明显的负相关。 GSTM3基因启动子低甲基化可以使TL1A表达升高， 进而导致机体纤维化进一步 发展， 正常的 肝功能受损。 甲基化荧光定量法是目前应用最为广泛的DNA甲基化(Methylight)检测方法，说　明　书 1/9 页 3 CN 114891877 A 3