(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210535784.2 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 深圳市罗湖医院集团 地址 518005 广东省深圳市罗湖区南湖街 道友谊路47号 申请人 曹韪凡　曹峰林 (72)发明人 曹峰林　曹韪凡　孙喜琢　张学记　 黎宗保　刘韬　黄浩　赵自垒　 曹涵　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 专利代理师 李红媛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/682(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种针对甲状腺癌 的多基因甲基化联合量 化检测方法 (57)摘要 一种针对甲状腺癌 的多基因甲基化联合量 化检测方法， 它涉及基因检测领域， 本发明解决 现有技术 成本高、 难以检测多位点以及检测精度 不高的问题； 解决甲状 腺癌诊断的基因甲基化的 量化分析无法与疾病发生发展的定性关联的问 题。 本发明采用重亚硫酸盐转化后的甲基化DNA 为模板， 进行两轮PCR扩增反应。 两次PCR扩增 实 现了甲基化信号的逐级放大， 提高了检测的灵敏 度和准确性， 使样本的适用范围更加广泛。 通过 使用质谱平台检测 信号， 能够量化检测多种基因 甲基化位点， 且有高准确度、 高敏感性以及高检 测通量等特点， 构建针对甲状 腺癌诊断的基因甲 基化量化检测分析体系。 本发明应用于甲状腺癌 检测领域。 权利要求书3页 说明书10页 附图2页 CN 115305285 A 2022.11.08 CN 115305285 A 1.一种针对甲状腺癌多基因 甲基化联合量化检测方法， 其特征在于它是按照以下步骤 进行的： 步骤一， 血浆分离 取血浆在1600g条件下离心10min离心后， 收集上清， 再次以16000g离心10min后， 获得 分离后的血浆； 步骤二， 取上一步的血浆， 提取血浆中游离 的cfDNA； 采用重亚硫酸盐处理cfDNA； 使用 PCR引物对经重亚硫酸盐处理的DNA样本进行PCR扩增， 得到甲基化特异性产物， 即为cfDNA 基因组甲基化文库； 所述的cfDNA基因组甲基化文库构建是采用甲基化文库制备试剂盒完成， 其中所用引 物序列如下： 步骤三， 使用质谱平台对上一步的PCR产物进行检测， 即完成所述的多基因 甲基化联合 量化检测。 2.根据权利要求1所述的一种针对甲状腺癌的多基因甲基化联合量化检测方法， 其特 征在于， 步骤二中所述的PCR扩增中的体系和程序如下： PCR扩增体系： 2 ×Taq酶mix 10uL， 引物1.6uL， 水4.4uL， 模板4uL； PCR扩增程序： 95℃2mi n， 95℃15s， 57℃2 2s， 72℃3 0s， 72℃5mi n， 4℃保温。 3.根据权利要求1所述的一种针对甲状腺癌的多基因甲基化联合量化检测方法， 其特 征在于， 步骤二中所述的重亚硫酸盐处理cfDNA是以EZ  DNA Methylation  KitTM试剂盒进行 重亚硫酸盐处 理。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115305285 A 24.根据权利要求3所述的一种针对甲状腺癌的多基因甲基化联合量化检测方法， 其特 征在于， 所述的以EZ  DNA Methylati on KitTM试剂盒进行重亚硫酸盐处 理具体操作如下： 1)处理之前配制CT转换 试剂和M‑缓冲液； 所述的CT转换 试剂配制方法如下： 加入750μL水和210μL  M‑Dilution  Buffer到一瓶CT转换试剂里， 然后每涡旋震荡1 ‑ 2min后停止， 再涡旋震荡1 ‑2min， 重复操作直到涡旋震荡时间累积至10min， 将已配制好的 CT转换试剂储存在室温且阴暗的地方， 直到使用为止； 所述的M‑缓冲液配制： 向M‑浓缩物中加入24mL的体积百分含量 为100％的无水乙醇， 即得M ‑缓冲液； 2)按照如下体系配制cfDNA样本 5 μL M‑Dilution Buffer+10 μL  cfDNA+35 μL水； 其中， cfDNA浓度为5 00ng/ μL‑1 μg/ μL； 3)将上一 步的样本在37℃环境中放置15mi n； 4)向样本中加入10 0 μL已配制好的CT转换 试剂， 涡旋震荡； 5)样本按照如下进行PCR反应 步骤1:95℃， 3 0s； 步骤2:50℃， 15mi n； 步骤3:重复步骤1 ‑2， 20个循环； 步骤4:4℃保温； 6)将上一 步处理的样本放置 于冰上10mi n； 7)加入40 0 μl M‑Binding Buffer到样本里， 上 下混匀； 8)将样本移到Zymo ‑Spin I离心柱中， 将离心柱放到2 ml收集管中， 以大于等于10,000g 的速度离心15 ‑30s， 弃滤液； 加入200 μL  M‑缓冲液到离心柱中， 以大于等于10,000g的速度 离心15‑30s， 弃滤液； 加入2 00 μL M‑Desulphonation  Buffer到离心柱中， 在2 0℃‑30℃温度 下放置15min， 然后以大于等于10,000g的速度离心15 ‑30s， 弃滤液； 再加入200 μL  M‑缓冲液 到离心柱中， 以大于等于10,000g的速度离心15 ‑30s， 弃滤液； 再加入200 μL  M‑缓冲液到离 心柱中， 以大于等于10,000g的速度离心1min， 弃滤液； 用60 μL水将DNA洗脱， 即得处理后的 cfDNA； 9)脱盐处 理 9.1将6mg洁净树脂加入到384孔的含有上述处理后的cfDNA的波纹板上， 风干至少 10min； 然后在样本板每一个有样本的孔里加入水至20 μL； 所述的含有上述处理后的cfDNA 的波纹板， 其中的cfDNA含量 为1 μL； 9.2将样本板凌空反转， 放在已放树脂的波纹板上， 然后将波纹板连样本板一起反转， 使树脂掉到孔中， 然后用膜将样本板封好， 放在旋转器上颠倒摇匀15min， 以3200g离心 5min， 即完成脱盐处 理。 5.根据权利要求1所述的一种针对甲状腺癌诊断的多基因甲基化联合量化检测方法， 其特征在于， 步骤三中使用质 谱平台对上一步的PCR产物进行检测， 是按照以下步骤进行 的： 步骤一、 点样 1)用点样仪进行体积测试以找出合适的点样速度， 点4点标准品的点样速度至少为权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115305285 A 3