(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210541772.0 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 重庆市农业科 学院 地址 400050 重庆市九龙坡区白市驿镇高 峰寺村 (72)发明人 欧阳杰　李贤勇　王楚桃　刘剑飞　 何永歆　朱子超　黄乾龙　管玉圣　 蒋刚　熊英　 (74)专利代理 机构 广州广典知识产权代理事务 所(普通合伙) 44365 专利代理师 万志香 (51)Int.Cl. C12N 15/54(2006.01) C12N 9/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称 水稻蜡质基因Wx的突变 基因及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种水稻蜡质基因Wx的突变 基因及其应用， 所述突变基因的核苷酸序列如 SEQIDNO.1所示。 本发明发现水稻蜡质基因Wx第9 个外显子第202位的T →C的碱基突变， 会使水稻 中抗性淀粉的含量提高， 水稻蜡质基因Wx的突变 基因是与高抗性淀粉含量密切相关的基因； 根据 该突变基因的突变位点设计引物对， 再对水稻基 因组DNA进行扩增， 通过核 酸电泳， 即可有效地检 测水稻品种是否为高抗性淀粉含量的水稻品种， 并且能够对移栽前的水稻幼苗的基因型进行快 速鉴定， 从而可以有选择性地移栽， 大大提高了 高抗性淀粉含量的水稻品种的选择效率， 加速育 种进程。 权利要求书1页 说明书10页 序列表4页 附图1页 CN 115197952 A 2022.10.18 CN 115197952 A 1.一种水稻蜡质基因Wx的突变基因， 其特征在于， 所述突变基因的核苷酸序列如SEQ   ID NO.1所示。 2.一种水稻蜡质基因Wx的突变基因的编码蛋白， 其特征在于， 所述编码蛋白的氨基酸 序列如SEQ  ID NO.2所示。 3.权利要求1所述的突变基因或权利要求2所述的突变基因的编码蛋白在筛选高抗性 淀粉含量的水稻中的应用。 4.一种筛选高抗性淀粉含量的水稻的引物对， 其特征在于， 所述引物对包括核苷酸序 列如SEQ ID NO.5～SEQ  ID NO.8所示的引物。 5.一种筛选高抗性淀粉含量的水稻的引物对， 其特征在于， 所述引物对包括核苷酸序 列如SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.9和SEQ  ID NO.10所示的引物。 6.一种筛选高抗性淀粉含量的水稻的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求4 所示的引物对， 或所述试剂盒包括权利要求5所示的引物对。 7.根据权利要求6所述的筛选 高抗性淀粉含量的水稻的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括Taq DNA聚合酶、 PCR缓冲体系和dNTP。 8.一种筛 选高抗性淀粉含量的水稻的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： (1)、 以待筛选水稻的基因组DNA为模板， SEQ  ID NO.5～SEQ  ID NO.8或SEQ  ID NO.5、 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.9和SEQ  ID NO.10为引物， 进行PCR扩增； (2)、 核酸电泳检测扩增产物的谱带， 鉴定水稻 蜡质基因Wx第9个外显子第202位处是否 具有T→C的碱基突变。 9.一种筛 选高抗性淀粉含量的水稻的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： (1)、 以待筛选水稻的基因组DNA为模板， SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4为引物， 进行PCR 扩增； (2)、 对PCR扩增产物进行测序， 检测水稻 蜡质基因Wx第9个外显子第202位处是否具有T →C的碱基突变。 10.根据权利要求9所述的筛选高抗性淀粉含量的水稻的方法， 其特征在于， 步骤(2)中 还包括检测扩增产 物中水稻蜡质基因Wx第10个外显子的第115位处是否具有C →T的碱基突 变， 或检测扩增产物中水稻蜡质基因Wx编码的氨基酸序列第415位是否具有脯氨酸 →丝氨 酸的氨基酸 突变。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115197952 A 2水稻蜡质基因Wx的突变基因及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子遗传学技术领域， 更具体地说， 本发明涉及一种水稻蜡质基因Wx 的突变基因及其应用。 背景技术 [0002]水稻蜡质基因Wx编码结合态淀粉合成酶(Granule ‑Bound Starch Synthase, GBSS)， 该酶催化合成直链淀粉， 影响水稻直链淀粉含量(Amylose  content,AC)， 是决定直 链淀粉含量的主效基因。 [0003]抗性淀粉(Resistant  Starch， RS)最初由Englyst等(1982)提出， 在人体的小肠中 不被吸收， 可降低餐后血糖水平， 增加饱腹感， 满足糖尿病人食用米饭的愿望， 降低肥胖风 险， 提升2型糖尿病患者的胰岛素敏感性、 防止慢性肾病(Kieffer  et al.,2016； Bindels   et al.,2017； Emilien  et al.， 2017)。 食用大米中有近80％的成分都是淀粉， 但大多数水 稻品种的RS含量低于3％(Yang  et al.,2006； Hu et al.,2004)， 高RS品种匮乏。 因此， 培育 高RS水稻品种具有重要的应用价 值。 [0004]研究表明， RS与直链淀粉的比例呈正相关(Cai  et al.,2015； Lin  et al.,2016； Chen et al.,2017； Xia  et al.2018)， 水稻的蜡质基因Wx和RS含量间存在显著的相关性 (Cai et al.,2015； Lin  et al.,2016； Chen  et al.,2017； Xia  et al.2018)， 是调控RS含 量的主效基因， 也是决定不同水稻品种间RS含量的主效基因(Raben  et al.,1994； Fitzgerald  et al.,2011)。 [0005]Bao等(20 17)通过全基因组关联分析， 得到与水稻RS相关的4个候选基因都是与直 链淀粉和支链淀粉合成有关的基因： Wx、 SS Ⅱa、 ISA1和AGPS1。 水稻SBE3基因通过引入分支 来促进支链淀粉的合成， 研 究发现， SBE3基因单碱基的突变， 使得第599位的亮氨酸转变为 脯氨酸， RS含量由0.41％提高至11.67％(Yang  et al.,2012)。 Zhou等(2016)发现SS Ⅲa基 因突变后显著提高了水稻中RS的含量， 其对RS的调控依赖 于Wx基因的高表达 。 [0006]Wxa基因是籼稻中最普遍的等位基因， 这类品种具有较 高的直链淀粉(成太辉和杨 武,2017)， 而Wxa基因第10外显子的C/T位点决定了稻米胶稠度和软硬(Tran  et al., 2011)。 [0007]高RS水稻品种的培育不可避免的要对大量中间材料进行RS含量的测定筛选， 但目 前RS含量主要 是化学测定方法， 测定步骤繁琐、 效率低， 测定成本高、 重复性差。 如果能够开 发出跟目标性状紧密连锁的分子标记， 应用于杂交后代中高RS含量单株的筛选， 将极大地 提高育种效率。 [0008]基于表型选择的常规育种方法存在选择效率低和育种周期长等缺点， 迫切需要注 入现代分子技术手段， 辅之于高效率地基因型定 向选择， 才能快速高效地培育出优异水稻 新品种。 随着分子生物学和 基因组学的迅速发展， 分子标记技术的应用更加广泛。 基于PCR 的分子标记如微卫星或SSR(simple  sequence  repeat)等具有多态率高、 相对 稳定、 检测方 法简便快速及易于操作等特点而被广泛的应用。 由于分子标记辅助选择不易受环境因素影说　明　书 1/10 页 3 CN 115197952 A 3