(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210540556.4 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 广州奕昕生物科技有限公司 地址 510700 广东省广州市黄埔区科 学城 玉树工业园敬业 三街1号H栋201房 (72)发明人 涂传明　马铃铃　黄庚锐　房皓静　 许锦涛　 (74)专利代理 机构 广州专理知识产权代理事务 所(普通合伙) 44493 专利代理师 曲超 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物 组、 试剂盒以及检测方法 (57)摘要 本发明属于生物检测的技术领域， 具体涉及 一种基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒的引物组、 试剂盒以及检测方法。 所述引物组包括外引物对 F3和B3、 内引物对BIP和FIP、 以及分子信标探针 LF‑MB； 所述外引物对F3和B3的核酸序列分别如 序列表SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示： 所述内 引物对BIP和FIP的核酸序列分别如序列表SEQ   ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示； 所述分子信标探针 LF‑MB的核酸序列分别如序列表SEQ  ID NO.7所 示。 本发明建立了用于新型冠状病毒检测的MB ‑ LAMP方法， 可 实现实时监测反应， 具有高特异性、 高灵敏度和快速高效的优点。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114807445 A 2022.07.29 CN 114807445 A 1.一种基于 MB‑LAMP检测新型 冠状病毒的引物组， 其特 征在于， 所述引物组包括外引物对F3和B3、 内引物对BIP和FIP、 以及分子信标探针LF ‑MB； 所述外引物对F3和B3的核酸序列分别如序列表SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示： 所述内引物对BIP和FIP的核酸序列分别如序列表SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示。 2.根据权利要求1所述的基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒 的引物组， 其特征在于， 所述 分子信标探针LF ‑MB全长25bp， 其包括中环状区域和茎干区， 所述中环状区域选自环引物 LF 的13个碱基， 在环引物LF的5 ’端修饰荧光基团， 3 ’端修饰猝灭基团； 所述环引物LF、 LB以及 分子信标探针LF ‑MB的核酸序列分别如序列表SEQ  ID NO.5、 SEQ ID NO.6和SEQ  ID NO.7所 示。 3.根据权利 要求1或2的基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒的引物组， 其特征在于， 所述外 引物对F3和B3、 内引物对BIP和FIP、 以及分子信标探针LF ‑MB的使用体积比为1:1:1:1:1。 4.根据权利要求1所述的基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒 的引物组， 其特征在于， 所述 荧光基团包括FAM、 TET、 JOE、 Cy3、 Cy5、 Cy5.5、 Lluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine  Red、 Rhodamine  6G、 Orengon  Green 488、 Orengon  Green 500、 Orengon  Green 514、 Texas  Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridi ne orange、 ROX的一种以上。 5.根据权利要求1所述的基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒 的引物组， 其特征在于， 所述 猝灭基团包括DABC YL、 DABSYL、 TAMRA、 BHQ ‑1、 BHQ‑2、 BHQ‑3的一种以上。 6.一种权利 要求1～5任一项所述的基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒的引物组在制备检 测新型冠状病毒的试剂或试剂盒的应用。 7.一种基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要 求2所述的外引物对F3和B3、 内引物对BIP和FIP、 以及分子信标探针LF ‑MB； 所述试剂盒还 包括阳性对照和阴性对照。 8.一种基于 MB‑LAMP检测新型 冠状病毒的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1)提取待测核酸； 2)设计引物和探针： 包括权利要求1所述序列表SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.4以及权利 要求2所述序列表SEQ  ID NO.5SEQ ID NO.7的序列； 3)将步骤1)所提取的待测核酸以及步骤2)的引物和探针置于LAMP反应体系内进行扩 增反应， 每6 0秒收集一次荧光信号进行实时荧 光检测； 4)根据荧光检测得到的曲线图， 所得曲线有 “S”型则为阳性结果， 所的曲线无 “S”型则 为阴性结果。 9.根据权利要求8所述的基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒的方法， 其特征在于， 步骤3) 所述LAMP反应体系， 以总体积为25 μL计， 包括10x  Thermopol反应缓冲液2.5 μL、 5 μM引物F3   1μL、 5 μM引物B3  1μL、 40 μM引物FIP  1μL、 40 μM引物BIP  1μL、 20 μM分子信标探针LF ‑MB 1μL、 8000U/mL  Bst 2.0DNA聚合酶1.5μL、 10mmol/L  dNTP MIX 5μL、 100mmol/L  MgSO4 1.0μL、 5mol/L甜菜碱0.5 μL、 核酸模板1 μL， PCR级纯 净水补足至25 μL。 10.根据权利 要求8所述的基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒的方法， 其特征在于， 步骤3) 所述LAMP反应 体系进行扩增反应的条件为6 5℃反应90mi n， 80℃保温10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807445 A 2一种基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒 的引物组、 试剂盒以及检 测方法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测的技术领域， 具体涉及一种基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒 的引物组、 试剂盒以及检测方法。 背景技术 [0002]新型冠状病毒(SARS ‑CoV‑2)的传播途径主要通过呼吸道飞沫和密切接触， 人群普 遍易感； 该病毒感染具有潜伏期(1～14天)， 潜伏期器件的病人一般无症状， 但已经具备很 强的传染性。 目前SARS ‑CoV‑2病毒感染的临床初步诊断主要依据流行病学史、 发热、 咳嗽、 肺部毛玻璃样改变为主， 确诊则需通过荧光实时定量PCR(RT ‑PCR)进行病毒核酸载量检测 或通过二代测序进 行病毒核酸序列分析。 然而RT ‑PCR病毒核酸检测与二代测序存在检测时 间和周期长、 环境要求高、 技 术力量要求高、 硬件设备要求高等 一系列问题。 [0003]近年来， 核酸等温扩增技术在物种鉴定中发挥着重要作用。 与P  CR技术相比， 等温 核酸扩增反应是一种 无需反复升降温， 在同一温度下即可完成对靶标指数扩增的技术， 其 中， 环介导等温扩增技术(L  oop‑mediated  isothermal amplification， LA MP)是目前研究 最多、 最成熟的一种等温扩增技术， 其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物， 在链 置换DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的作用下， 60 ‑65℃恒温扩增， 在一小时内即可实现 核酸扩增 。 但是， LAMP产物易受气溶胶污染， 造成假阳性结果。 如反应后开盖时造成气溶胶 的污染， 其次， LAMP反应中使用的引物总浓度为3.6～4.4 μM， 而在P  CR反应中仅为0.4～1.0 μM。 其中LAMP的FIP和BIP引物长度为40～50bp， 比较容易形成引物二聚体或发夹结构， 导致 荧光染料与LA  MP引物结合产生非特异性扩增。 [0004]分子信标(molecular  beacon， MB)是1996年Tyagi等发明的一种有茎环结构的荧 光探针。 当没有靶序列存在时， 分子信标探针低温时自身闭合， 荧光基团和淬灭基团相互靠 近而不发荧光； 在有靶序列存在的情况下， 分子信标低温时与 互补的靶序列形成稳定的双 链杂交体， 使荧光基团和淬灭基团分离， 发出荧光， 随着循环 次数的增加， 与模板结合的分 子信标的量亦增加， 最 终的荧光 强度与扩增的模板量成正比。 该技术具有极高的特异性， 而 且操作简 便、 灵敏度高， 还可以进 行实时检测。 但分子信标必须在适合反应的等温温度下与 其靶标杂交， 可以通过选择合适的探针和臂序列长度来实现， 环部序列较长可增加探针与 靶标结合的特异性， 但是会降低与靶标的结合效率， 同时会有可能形成二级结构， 不利于 LAMP的扩增检测； 而环部较短会降低检测灵敏度， 荧光基团与 猝灭基团之间的距离减小， 会 增加意外猝灭的可能性。 [0005]因此， 在传统LAMP技术 的基础上， 开发出利用分子信标探针技术实现对LAMP扩增 产物进行检测的方法用于新型 冠状病毒的核酸检测尤为重要。 发明内容 [0006]针对上述问题， 本发明的目的在于提供一种基于MB ‑LAMP检测新型冠状病毒的引说　明　书 1/5 页 3 CN 114807445 A 3