(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210536531.7 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 丁芳　周佳乐　洪霓　王国平　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 同步检测多种柑橘病原的检测引物组合物、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了同步检测多种柑橘病原的检 测引物组合物、 试剂盒及方法， 所述柑橘病原包 括柑橘黄 龙病菌、 柑橘衰退病毒、 柑橘碎叶病毒、 柑橘裂皮病类病毒、 柑橘叶斑驳病毒、 柑橘黄化 脉明病毒， 用于同步检测上述病原的引物组合物 的序列具体如SEQ  ID NO.1～12所示， 并进一步 通过引物浓度、 PCR扩增条件等的优化， 实现了至 少5种病原的同步、 特异 检测。 本发明构建的检测 技术体系具有快速、 灵敏、 特异性强、 重复性好、 高通量等优点， 可为生产中柑橘栽培品种大规模 引进、 柑橘苗木无毒化示范推广等工作提供技术 支撑， 从而为柑橘产业 健康发展提供技 术保障。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 114959114 A 2022.08.30 CN 114959114 A 1.一种同步检测多种柑橘病原的多重PCR检测引物 组合物， 其特征在于， 所述引物 组合 物包括以下引物对中的至少5对： 用于柑橘黄龙病菌 CLas检测的引物对： 上游引物： 5 ’ ‑TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC‑3’， 下游引物： 5 ’ ‑AGAATTCGACTTAATCCCCACCT‑3’， 用于柑橘衰退病毒CTV检测的引物对： 上游引物： 5 ’ ‑GCTTCTTAACCTACGCGAT ‑3’， 下游引物： 5 ’ ‑ACAAATCCACTTCAACACC‑3’； 用于柑橘碎叶病毒CTLV检测的引物对： 上游引物： 5 ’ ‑CCCTCTCAGCTAGA ATTGAA‑3’， 下游引物： 5 ’ ‑CAGGCATGTCA ACCTGCAAG‑3’； 用于柑橘裂皮病类病毒C EVd检测的引物对： 上游引物： 5 ’ ‑GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG‑3’， 下游引物： 5 ’ ‑CCGGGGATCCCTGAAGGACTT‑3’； 用于柑橘叶斑驳病毒CLBV检测的引物对： 上游引物： 5 ’ ‑CCAATGATAATGCCGCGAC‑3’， 下游引物： 5 ’ ‑CCCGAGGTTCTTATTGCAT‑3’； 用于柑橘黄化脉明病毒C YVCV检测的引物对： 上游引物： 5 ’ ‑CTCCAACTCACAAACCCAG‑3’， 下游引物： 5 ’ ‑ATGGGCTCTTGGTTTTCCT‑3’。 2.一种同步检测多种柑橘病原的多重PCR检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所 述的引物组合物。 3.根据权利要求2所述的多重PCR检测试剂盒， 其特 征在于， 包括用于PCR扩增的试剂。 4.一种同步检测多种柑橘病原的多重PCR检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)待测植物样品的核酸 提取； (2)对步骤(1)所 得核酸提取液进行逆转录； (3)使用权利要求1所述引物组合物对步骤(2)所得逆转录待测 样品进行PCR扩增， 产物 进行琼脂糖凝胶电泳检测。 5.根据权利要求4所述同步检测多种柑橘病原 的多重PCR检测方法， 其特征在于， 所述 PCR扩增的程序为： 94℃， 3mi n； 94℃30s， 55℃30s， 72℃3 0s， 30个循环； 72℃， 5mi n。 6.根据权利要求4所述同步检测多种柑橘病原 的多重PCR检测方法， 其特征在于， 所述 PCR扩增的反应体系为： 共20 μL， 2 ×Master Mix 10 μL， 0.2 μL～0.40 μL的各引物对， 待检测 样品cDNA模板1.0 μL， d dH2O余量。 7.根据权利要求4所述同步检测多种柑橘病原 的多重PCR检测方法， 其特征在于， 步骤 (1)具体为： 将植物染病叶片研磨后与Tr izol试剂混匀， 离心取上清， 加入氯仿抽提； 离心取 上清， 加入异丙醇混匀， 沉降后离心弃上清； 采用乙醇洗涤沉淀， 再在沉淀中加入DEPC水使 沉淀溶解， 即为核酸 提取液。 8.根据权利要求4所述同步检测多种柑橘病原 的多重PCR检测方法， 其特征在于， 步骤 (2)具体为： 取步骤(1)制备的核酸提取液， 加入随机引物， 先沸水浴再迅速冷却后， 加入反权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114959114 A 2转录试剂， 混匀后37℃水浴1.0～1.5 h后， 先沸水浴再迅速冷却， 得到逆转录待测样品。 9.根据权利要求4所述同步检测多种柑橘病原 的多重PCR检测方法， 其特征在于， 所述 琼脂糖凝胶电泳检测得到的特异性片段大小为： 柑橘黄龙病菌为535bp， 柑橘衰退病毒为 474bp， 柑橘碎叶病毒为801bp， 柑橘裂皮病类病毒为371bp， 柑橘叶斑驳病毒为724bp， 柑橘 黄化脉明病毒为175bp。 10.根据权利要求9所述同步检测多种柑橘病原的多重PCR检测方法， 其特征在于， 所述 产物在2.0％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114959114 A 3