(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210531128.5 (22)申请日 2022.05.16 (71)申请人 中南大学 地址 410000 湖南省长 沙市岳麓区麓山 南 路932号 (72)发明人 孟凡明　罗艺菲　刘子超　张磊　 (74)专利代理 机构 北京盛询知识产权代理有限 公司 11901 专利代理师 方亚兵 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物 及方法 (57)摘要 本发明公开了云南牛蛭线粒体全基因组序 列的扩增引物及方法， 属于基因工程技术领域。 所述扩增引物包括如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID  NO.28所示的14对特异性引物对， 利用上述14对 特异性扩增引物对云南牛蛭基因组进行PCR扩 增， 扩增产物电泳后进行测序及序列拼接， 获得 云南牛蛭线粒体全基因组序列， 这为该物种的药 用研究、 物种鉴定、 进化遗传学及系统演化研究 提供一定的基础资料和技 术支持。 权利要求书1页 说明书9页 序列表11页 附图2页 CN 115029447 A 2022.09.09 CN 115029447 A 1.一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物， 其特征在于， 包括如下14对对引物 对： (1)第1对引物为如SEQ  ID NO.1所示的上游引物和SEQ  ID NO.2所示的下游引物； (2) 第2对引物为如SEQ  ID NO.3所示的上游引物和SEQ  ID NO.4所示的下游引物； (3)第3对引 物为如SEQ  ID NO.5所示的上游引物和SEQ  ID NO.6所示的下游引物； (4)第4对引物为如 SEQ ID NO.7所示的上游引 物和SEQ ID NO.8所示的下游引 物； (5)第5对引 物为如SEQ  ID  NO.9所示的上游引物和SEQ  ID NO.10所示的下游引物； (6)第6对引物为如SEQ  ID NO.11所 示的上游引物和SEQ  ID NO.12所示的下游引物； (7)第7对引物为如SEQ  ID NO.13所示的上 游引物和SEQ  ID NO.14所示的下游引物； (8)第8 对引物为如SEQ  ID NO.15所示的上游引物 和SEQ ID NO.16所示的下游引物； (9)第9对引物为如SEQ  ID NO.17所示的上游引物和SEQ   ID NO.18所示的下游引 物； (10)第10对引 物为如SEQ  ID NO.19所示的上游引物和SEQ  ID  NO.20所示的下游引物； (11)第11对引物为如SEQ  ID NO.21所示的上游引物和SEQ  ID  NO.22所示的下游引物； (12)第12对引物为如SEQ  ID NO.23所示的上游引物和SEQ  ID  NO.24所示的下游引物； (13)第13对引物为如SEQ  ID NO.25所示的上游引物和SEQ  ID  NO.26所示的下游引物； (14)第14对引物为如SEQ  ID NO.27所示的上游引物和SEQ  ID  NO.28所示的下游引物。 2.如权利要求1所述的扩增引物在云南牛蛭线粒体全基因 组序列扩增中的应用。 3.一种利用如权利要求1所述的扩增引物扩增云南牛蛭线粒体全基因组序列的方法， 其特征在于， 包括以提取的云南牛蛭基因组DNA为模板， 利用所述的扩增引物进 行PCR扩增， 所得扩增产物进行琼脂糖电泳检测、 测序。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 扩增反应体系包括： DNA模板60ng、 0.2 ‑1.0 μM 引物各1.5 μL， 2.5 mM dNTP 8 μL、 10×PCR Buffer 5 μL、 2.0mM MgCl2 1 μL、 Tap酶0.5 μL， 余量 用无核酸酶水补齐5 0 μL。 5.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 扩增程序 为： 94℃预变性2min， 94℃变性30s， 55℃退火3 0s， 72℃延伸6 0s， 共35个循环， 最后72℃延伸10mi n。 6.如权利 要求3所述的方法， 其特征在于， 所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.29 所示。 7.一种扩增云南牛蛭线粒体全基因组序列的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述 的扩增引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029447 A 2云南牛蛭 线粒体全基因组序列的扩增引物及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及基 因工程技术领域， 特别是涉及一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的 扩增引物及方法。 背景技术 [0002]云南牛蛭Hirudinidea  Poecilobdella， 属于颚蛭目(Gnathobdellida)， 医蛭科 (Hirudidae)， 牛蛭属(Hirudinaria  Whitman)。 云南牛蛭为无脊椎软体动物， 无骨架结构， 全体均可以利用； 主要成分是蛋白质、 多肽、 微量元素和脂肪酸素等。 在内陆淡水水域内生 长繁殖， 是我国传统的特种药用水生动物， 其干制品炮制后中医入药， 具有治疗中风、 高血 压、 清淤、 闭经、 跌打损伤等功效。 [0003]云南具有丰富的蛭类资源， 在全国发现的相关物种中， 云南蛭类占中国 已知蛭类 1/3以上， 云南一些特有种为其它地方所罕见。 近些年新 发现水蛭制剂在防治心脑血管疾病 和抗癌方面具有特效， 因此该物种 可为药用研究和物种鉴定、 进化遗传学及系统演化研究 提供一定的基础资料和技术支持。 线粒体基因组是生物重要的遗传物质， 其中后生动物线 粒体DNA为典型的环状分子结构， 长度大多在14 ‑18kb之间， 编码37个基因， 包括13个蛋白质 基因， 22个tRNA以及12S  rRNA和16S  rRNA。 线粒体DNA是核外遗传物质， 具有分子量小、 结构 简单、 母系遗传等特点， 成为生物多样性、 群体遗传学与系统进化研究中的重要分子标记。 鉴于目前该科类群遗传学尤其是线粒体基因组方面的信息量比较少， 开展其线粒体基因组 全序列的研究就显得十分必要。 [0004]目前扩增线粒体基因组全序列的方法大多采用引物步移法， 通过对 公共数据库中 近缘物种线粒体基因组中保守区设计引物， 对目标区域扩增序列并测序,对测序得到的序 列再继续设计引物进 行扩增测序， 重复这一步骤直到测序得到的全部序列经拼接后获得完 整线粒体基因组序列位置。 以往的引物扩增反应后产物长度较 短(400‑500bp)， 按照线粒体 基因组大小15000bp计算， 需要设计30对以上的引物 来完成全部片段的扩增和有效拼接， 费 时费力， 且反复扩增 测序导致错误率升高， 影响测序后的拼接结果和注释准确性。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法， 以解 决上述现有技术存在的问题， 通过筛选得到14对特异性引物， 并用于扩增云南牛蛭线粒体 全基因序列， 这为云南牛蛭的药用研究、 物种鉴定、 进化遗传学及系统演化研究提供一定的 基础资料和技 术支持。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0007]本发明提供一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物， 包括如下14对对引物 对： [0008](1)第1对引物为如SEQ  ID NO.1所示的上游引物和S EQ ID NO.2所示的下游引物； (2)第2对引物为如SEQ  ID NO.3所示的上游引物和SEQ  ID NO.4所示的下游引物； (3)第3对说　明　书 1/9 页 3 CN 115029447 A 3