(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210528209.X (22)申请日 2022.05.16 (71)申请人 河南省农业科 学院农业质量标准与 检测技术研究所 地址 450003 河南省郑州市金 水区花园路 116号 (72)发明人 王红旗　郑嘉　王俊艳　尹海燕　 刘继红　马莹　张军锋　 (74)专利代理 机构 郑州优盾知识产权代理有限 公司 41125 专利代理师 冉珊敏 (51)Int.Cl. G01N 33/53(2006.01) G01N 33/532(2006.01) G01N 33/543(2006.01)G01N 33/58(2006.01) C12Q 1/6834(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于链置换-表 面临近杂交的多抗生素可视 化检测试纸条及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明属于抗生素检测领域， 涉及可视化检 测试纸条， 特别是指基于链置换 ‑表面临近杂交 的多抗生素可视化检测试纸条及其制备方法和 应用。 检测试纸采用圆形设计， 点样孔在圆心， 可 根据需要检测的抗生素种类分成多个检测区域。 链置换探针与适配体预先退火杂交形成 复合物， 与光学纳米材料碳点标记的信号探针一同加入 样品提取液， 混匀， 滴加到检测试纸中央样品区。 在靶标存在的情况下， 链置换探针被竞争下来与 信号探针一起随着提取液沿试纸继续往外扩散 迁移到达检测线。 该检测方案中检测带的亮度与 靶标的浓度成正比， 是一种signal ‑on检测模式。 该方法经济 快速、 特异性较好、 准确度高， 有望用 于土霉素、 氯霉素的快速 检测市场需求。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 114895021 A 2022.08.12 CN 114895021 A 1.基于链置换 ‑表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条的制备方法， 其特征在于， 步骤如下： （1） 分别设计土霉素和氯霉素的适配 体、 链置换探针、 信号探针、 检测探针和质控探针； （2） 制备碳 点CD1与信号探针反应， 得到碳 点标记的信号探针； （3） 将检测探针和质控探针分别固定在NC膜上的检测线和质控线。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中土霉素的适配体的序 列为5’ ‑bio‑(CH2)6‑GATCGGGTGTGGTTGGCGTAAAGGGAGCATCGG ‑3’、 链置换探针的序列为5 ’ ‑ CCGATGCTCCCTTTA ‑3’、 信号探针的序列为5 ’ ‑NH2‑(CH2)12‑TTTTTTTTTTAGCATCGGCCGTTAG ‑ 3’、 检测探针的序列为5 ’ ‑bio‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTATGCTCTTAAAGGG ‑3’以及质控 探针的序列 为5’ ‑bio‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTGATGCTC CCTT‑3’。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中氯霉素的适配体序列 为5’ ‑bio‑(CH2)6‑ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG ‑3’、 链置换探针的序列为 5’‑CTACCACCGACTCGCCGACCG ‑3’、 信号探针的序列为5 ’‑NH2‑(CH2)1 2‑ TTTTTTTTTTGTCGGTGGTAGTAGCCGT ‑3’、 检测探针的序列为5 ’‑bio‑(CH2)6‑ TTTTTTTTTTATGCTCTCGGTCGGCGA ‑3’和质控探针的序列为5 ’‑bio‑(CH2)6‑ TTTTTTTTTTCCACCGACTCGC CGA‑3’。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中碳点CD1的制备方法 为： 取1.26  g柠檬酸和1608  μl EDA溶于30  mL双蒸水中， 混合均匀 后转移至水热反应釜中， 180℃反应5 h， 所得产物经透析 纯化得到碳 点CD1。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中碳点标记 的信号探针 制备方法为： 取5  mg碳点CD1溶于 7.5 mL的0.1M， pH  7.2 Tris‑HCl缓冲液  中， 加入3mg  EDC 和4.5 mg NHS反应30  min， 再加入50   µL信号探针反应12  h， 随后用透析膜透析纯化， 得碳 点标记的信号探针。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中碳点标记 的信号探针 的固定机理为以ED C和NHS为交联剂将氨基修饰的信号探针固定到表 面含有羧基的碳点上， 形成酰胺键连接的碳 点标记的信号探针。 7.权利要求1 ‑6任一项所述的方法制备的基于链置换 ‑表面临近杂交的多抗生素可视 化检测试纸条， 所述多抗生素可视化检测试纸条为圆形， 点样孔在圆心， 检测区域呈360 °扇 形分布， 其特征在于： 从圆心点样孔向外依 次为固定有检测探针的检测线和固定有质控探 针的质控线。 8.权利要求7所述的多抗生素可视化检测试纸条的使用方法， 其特征在于： 将链置换探 针与适配体预先退火杂交形成复合物， 与碳点标记的信号探针一同加入样品提取液， 混匀， 滴加到检测试纸中央样品区进行检测。 9.权利要求7所述的多抗生素可视化检测试纸条在非疾病诊断目的的自来水、 农副产 品中土霉素和/或氯霉素的检测中应用。 10.根据权利 要求9所述的应用， 其特征在于： 所述土霉素的检测灵敏度≥24.6 μg/L； 氯 霉素的检测灵敏度＞10.26 μg/L。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114895021 A 2基于链置换 ‑表面临近 杂交的多抗生素可视化检测试纸条及 其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于抗生素检测领域， 涉及可视化检测试纸条， 特别是指基于链置换 ‑表面 临近杂交的多抗 生素可视化检测试纸条及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]我国是世界上最大的畜禽产品生产消费国家， 随着我国畜禽生产模式的发展， 专 业化、 集约型生产经营模式逐渐得到普及。 为了降低成本， 许多工业化畜禽的饲养环境越发 趋向更狭小的空间和更差的卫生条件， 这样一来病菌的滋长将无法避免。 所以， 为了畜禽的 健康、 快速生长， 大多数饲养者都会选择在饲养过程中长期使用抗生素。 数据显示， 2013年 中国抗生素总使用量约为16.2万吨， 超过了美国、 英国、 加拿大、 丹麦等 国的总和。 事实上， 被服用的抗生素大部 分 （约 30%~90%） 以母体或代谢物的形式被排出体外， 进而污染养殖场 周围的水土环境， 给附近的人民群众的饮水健康造成潜在威胁。 人如果长期低剂量摄入含 有抗生素的水、 肉食 会导致机体产生耐药性， 诱 导抗性基因， 最终危及人类健康。 [0003]核酸适配体作为一类单链寡核苷酸， 与 靶分子发生特异性相互作用前后空间构象 会发生相应的变化， 与抗体相比具有 可体外筛选获得、 热稳定性好、 易于化学合成和修饰等 优点， 甚至能区分单抗无法实现的单个取代基差别的靶分子。  各种基于核酸适配体的检测 方法与技术已呈现出快速、 灵敏、 方便、 低 成本等优点， 在生物医学应用中已经显示出广阔 的应用前景， 但在抗生素快检方面的应用却相 对较少。 2008年， Niazi等筛选到了四环素的 特异性DNA核酸适配体。 2010年， 张娟琨教授基于该核酸适配体开 发了电化学传感器用于牛 奶中四环素的检测， 检测限可达1ng ·mL‑1， 检测时间5  min 。 2010年， Kim等获得了土霉素的 核酸适配体， 开发了基于核酸适配体 ‑聚苯乙烯微球的光散射凝集分析法用于土霉素 的快 速检测， 整个检测过程只需3min， 检测限可达100  ppb。 在此基础上， 2014年， Kim等又开发了 酶联‑核酸适配体生物传感技术用于饲料中土霉素的检测， 该方法的IC  值约为59.7  ng· mL‑1。 2012年， Plehvar等开发了 免标记型电化学核酸适配体生物传感技术用于牛奶中氯霉 素的检测， 检测限可达1.6  nM。 本课题组前期在专利CN106680346A中， 研究了一种基于链置 换放大和表面临近杂交反应的AFB1电化学检测方法及应用， 该方法检测起来操作步骤复 杂、 检测时需要结合在丝网印刷电极表面引入电活性探针， 产生相应的电信号， 对电信号进 行检测， 再代入标准 曲线进行计算才能得出检测结果， 而根据多年的农产品质量安全风险 评估工作的调研情况来看， 该方法虽然精确度高， 但是在基层检验检测、 监督抽查时， 明显 不能及时、 快速、 随时 随地的实现检测， 因此本课题组为了实现大量样品的现场快速筛查分 析， 拟开发一种定性、 定量/半定量的可视化试纸生物传感技术， 以便为实验室确证分析节 省时间和费用， 进 而作出以下探索。 发明内容 [0004]为解决上述技术问题， 本发明提出一种基于链置换 ‑表面临近杂 交的多抗生素可说　明　书 1/6 页 3 CN 114895021 A 3