(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210524120.6 (22)申请日 2022.05.14 (71)申请人 上海小海龟科技有限公司 地址 200444 上海市宝山区园丰路69号2幢 401室 (72)发明人 赵哲浩　吕腾腾　徐刚伟　沈燕龙　 (74)专利代理 机构 上海佰特专利代理事务所 (普通合伙) 31464 专利代理师 吕玲玉 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 数字PCR检测HBV DNA的方法 (57)摘要 本发明提供一种数字PCR检测HBV  DNA的方 法。 本发明主要采用了酶切打断的方式对核酸样 本进行打断， 然后采用数字PCR的方法对样本进 行检测。 本方法提高了现有数字PCR平台的分析 性能， 将最低检出限从8copies/反应， 降至 4copies/反应以下。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图1页 CN 114854906 A 2022.08.05 CN 114854906 A 1.一种数字PCR检测HBV  DNA的方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： 对核酸样本 进行酶切打断， 然后采用数字PCR对核酸样本进行检测。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述酶选自DNA酶和/或限制性内切酶。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述DNA酶选自DNaseI或DN aseII中的任意 一种或两种， 所述限制性内切酶选自Hi ndIII、 BamHI、 或E coRI中的任意 一种或几种。 4.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述数字PCR对核酸检测位点选自HBV基因 组上的以下任意一个或几个位点： HBV ‑1： NC_003977.2(381..477)、 HBV ‑2： NC_003977.2 (1530..1631)或HBV ‑3： NC_003977.2(601..698)。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 针对权利要求4中所述的三个检测位点的 检测引物和探针为： 针对HBV‑1的正向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 针对HBV‑1的反向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 针对HBV‑1的探针序列如SEQ  ID NO.3所示， 针对HBV‑2的正向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示， 针对HBV‑2的反向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， 针对HBV‑2的探针序列如SEQ  ID NO.6所示， 针对HBV‑3的正向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示， 针对HBV‑3的反向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示， 针对HBV‑3的探针序列如SEQ  ID NO.9所示。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述核酸样本来自HBV患者血清或者血浆， 经纯化的核酸模板 。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述方法具体包括以下步骤： 1)对核酸样本进行 纯化； 2)对核酸样本进行酶切打断； 3)利用数字PCR的方法对样本进行检测。 8.根据权利要求7中所述的方法， 其特征在于， 所述步骤2)中酶切打断为:a)将核酸样 本置于PCR反应 体系外打断或者b)将核酸样本 置于PCR反应 体系中进行打断。 9.根据权利要求8中所述的方法， 其特征在于， 所述a)将核酸样本置于PCR反应体系外 打断， 具体为将核酸直接与酶混合， 离心， 37℃孵育10 ‑60min； 65 ‑95℃变性失活10 ‑30min, 然后进行步骤3)， 步骤3)中数字PCR反应程序为： 50℃固化5 ‑10min； 95℃预变性1 ‑5min； 95 ℃变性3‑10s， 55‑60℃退火25 ‑40s， 进行45 ‑50个循环； 25℃保温。 10.根据权利要求8中所述的方法， 其特征在于， 所述b)将核酸样本置于PCR反应体系中 进行打断， 具体为将核酸样 本和酶置于P CR反应体系中， 然后进 行步骤3)， 步骤3)中数字PCR 的反应程序为： 37℃酶切孵育10 ‑60min； 95℃ 预变性1‑5min； 95℃变性3 ‑10s， 55‑60℃退火 25‑40s， 进行45 ‑50个循环； 25℃保温。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854906 A 2数字PCR检测HBV  DNA的方法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 特别是 涉及数字PCR检测HBV  DNA的方法。 背景技术 [0002]数字PCR是全新一代PCR技术， 被称为第三代PCR技术。 相较于普通PCR(第一代PCR) 和荧光定量PCR(第二代)， 数字PCR具有更明显的优势， 如： 无需标准曲线的绝对定量功能、 更强的抗干扰能力、 单分子PCR分析等。 目前数字PCR技术已广泛应用于肿瘤突变、 优生优 育、 病原体等检测领域。 [0003]现有数字PCR技术以液滴式和芯片式为主， 其中微滴式多采用油包水的方式实现 微滴分散， 芯片式主要利用固态芯片中的微结构(腔室、 通道等)实现微滴分散。 理想情况 下， 在液滴分散过程中所有待测靶点都应随机分散到不同的反应单元中。 然而由于基因组 的完整性， 在同一DNA分子上的多个检测靶点会被 分散到同一个反应单元中， 因此无法实现 对多个待测模板的有效分散， 限制了数字PCR技 术检测灵敏度的提升 。 发明内容 [0004]鉴于以上所述现有技术的缺点， 本 发明的目的在 于提供一种数字PCR检测HBV  DNA 的方法， 用于解决现有技 术中数字PCR在对HBV  DNA进行检测时模板分散性差的问题。 [0005]本发明的一方面提供了一种数字PCR检测HBV  DNA的方法， 所述方法包括以下步 骤： 对核酸样本进行酶切打断， 然后采用数字PCR对核酸样本进行检测。 [0006]进一步地， 所述酶选自DNA酶和/或限制性内切酶。 所述DNA酶可以为DNaseI、 DNaseII等， 所述限制性内切酶可以是Hi ndIII、 BamHI、 E coRI等。 [0007]进一步地， 所述数字PCR对核酸检测位点选自HBV基因组(NC_003977)上 的任意一 个或者几个位点， 具体为： HBV ‑1： NC_003977.2(381..477)、 HBV ‑2： NC_003977.2 (1530..1631)或HBV ‑3： NC_003977.2(601..698)。 [0008]更进一步地， 针对上述 三个区域的检测引物和探针为： [0009]针对HBV‑1的正向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， [0010]针对HBV‑1的反向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， [0011]针对HBV‑1的探针序列如SEQ  ID NO.3所示， [0012]针对HBV‑2的正向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示， [0013]针对HBV‑2的反向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， [0014]针对HBV‑2的探针序列如SEQ  ID NO.6所示， [0015]针对HBV‑3的正向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示， [0016]针对HBV‑3的反向引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示， [0017]针对HBV‑3的探针序列如SEQ  ID NO.9所示。 [0018]进一步地， 所述核酸样本来自HBV患者血清、 血浆或其它样品中， 经纯化的核酸模 板。说　明　书 1/8 页 3 CN 114854906 A 3