(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210523775.1 (22)申请日 2022.05.13 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 白旭峰　谭云飞　蓬国辉　邢永忠　 彭波　孙俊霄　 (74)专利代理 机构 武汉宇晨专利事务所(普通 合伙) 42001 专利代理师 张红兵 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定 雌性克氏原螯虾的SSR标记及其应 用 (57)摘要 本发明属于动物分子标记筛选领域。 具体涉 及一种鉴定雌性克氏原螯虾的SSR标记及其应 用。 本发明主要步骤为(1)分别提取雌、 雄性克氏 原螯虾基因组DNA 。 (2)对雌雄群体克氏原螯虾的 DNA样本进行PCR检测， 设计相关引物扩增目片 段， 通过琼脂糖电泳检测目的片段是否被扩增 出。 (3)利用PAGE胶电泳检测并进行统计分析。 通 过PAGE胶电泳后显影、 读带， 对雌雄克氏原螯虾 群体间的带型进行统计分析。 结果表明： 检测到 的雌性和雄性克氏原螯虾群体样本显示所有雌 性或雄性样本在PCM1237位点含有A、 B、 C三种等 位基因， 雌性克氏原螯虾基因型为纯合型或杂合 型， 而雄性克氏原螯虾基因型仅为纯合型。 即杂 合型一定是雌性克氏原螯虾。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 114959056 A 2022.08.30 CN 114959056 A 1.一种SSR标记在 雌性克氏原螯虾鉴定 中的应用， 其特征在于， 所述的应用包括下列步 骤： 1)分别提取雌、 雄 性克氏原螯虾基因 组DNA， 每 个性别样本 至少提取15 0尾； 2)设计引物： 根据克氏原螯虾基因组测序数据， 利用Primer3软件设计正向引物 PCM1237 ‑F 5 '‑CGCACACTTCTTCACCCTCT ‑3 '和反向引物PCM1237 ‑R 5 '‑ AGGAGTCTTTTAACATGAGAGAT TTT‑3'； 3)对雌、 雄群 体克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测： 以正向引物PCM1237 ‑F 5'‑CGCACACTTCTTCACCCTCT ‑3'， 和反向引物PCM1237 ‑R 5'‑ AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT ‑3'扩增目的片段， 利用琼脂糖电泳检测目的片段是否被扩 增出； 4)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并进行统计分析： 将扩增出的PCR产物用4％的聚丙烯 酰胺凝胶进行电泳检测， 电泳胶板用0.2％的硝酸银溶液进行染色， 用含有0.5％甲醛溶液 的0.5M氢氧化钠溶 液进行显影、 漂洗和晾干， 对上述各个 群体进行带型统计分析； 5)检测到雌性和雄性克氏原螯虾群体样本， 显示所有雌性或雄性样本在PCM1237位点 是否含有A、 B、 C三种等位基因， 判定雌性克氏原螯虾基因型为纯合型或杂合型， 判定雄性克 氏原螯虾基因型仅为纯合型， 判定杂合型为雌性克氏原螯虾； PCR条件： 95℃预变性3min； 95℃变性30s； 58℃退火30s； 72℃延伸30s； 35次循环后； 72 ℃再延伸7mi n； 4℃保存。 2.一种SSR标记在雌性克氏原螯虾鉴定中的应用， 其特征在于， 所述的应用还包括用 SSR标记特异鉴定和筛 选雌性克氏原螯虾。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959056 A 2一种鉴定雌性克氏原螯 虾的SSR标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于水产动 物分子标记筛选技术领域， 具体涉及 一种鉴定雌性克氏原螯虾 的SSR分子标记的筛 选及其应用。 背景技术 [0002]克氏原螯虾(Pr ocambarua  clarkii)俗称小 龙虾， 隶属于十足目(Decapoda)、 螯虾 科(Ambar idae)， 是存活于淡水中的一种甲壳类动物。 克氏原虾原产于美国南部和墨西哥东 北部， 经由日本引入中国南京地区， 后逐步向整个长江流域等地区扩散； 由于其味道鲜美， 营养丰富， 深受人们喜爱， 目前小龙虾已成为我国重要的经济水产品。 [0003]目前， 虽然关于克氏原螯虾性别鉴定 的分子标记已有相关的专利文献和报道。 例 如沈宇东等， 2021提供了一种克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记及其筛选方法和应用 (申请号2021112932524)， 但是该文 献中标记引物只能特异扩增出雄性克氏原螯虾带型， 而 雌性克氏原螯虾则不能扩增出特异性条带(即， 无特异序列特征)。 沈宇东等2021年专利申 请所用的性别 分子标记若未扩增出特异性条带， 不能充分说明受检测的虾即为雌性， 这种 方法极易导致假阳性的结论。 为此， 本发明开发在雌性克氏原螯虾中能特异扩增出具有明 确序列特 征的标记， 对克氏原螯虾雌性个 体的鉴定具有重要的意 义。 发明内容 [0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 提供一种高效的鉴别雌性克氏原螯虾的 分子标记及其应用。 本发 明筛选出的SSR分子标记P CM1237， 不仅在雄、 雌性克氏原螯虾中均 能扩增出特异性条带， 而且通过选择其特异带型能鉴定出 的个体一定是雌性克氏原螯虾。 因此， 本发明的分子标记PC M1237可确切地鉴定出雌性克氏原螯虾。 [0005]本发明操作简便， 实验步骤少、 成本低， 能广 泛应用在生产实践中。 经检测， 该筛选 及鉴定方法能有效鉴别 雌性克氏原螯虾， 是一种基于DNA序列能有效鉴别 雌性克氏原螯虾 的分子标记及筛 选方法和鉴定方法。 [0006]本发明通过以下技 术方案实现： [0007]一种SSR标记在雌性克氏原螯虾鉴定中的应用， 所述的应用包括下列步骤： [0008]1)分别提取雌、 雄 性克氏原螯虾基因 组DNA， 每 个性别样本 至少提取15 0尾； [0009]2)设计引物： 根据克氏原螯虾基因组测序数据， 利用Primer3软件设计正向引物 PCM1237 ‑F5 '‑CGCACACTTCTTCACCCTCT ‑3 '和反向引物PCM1237 ‑R 5 '‑ AGGAGTCTTTTAACATGAGAGAT TTT‑3'； [0010]3)对雌、 雄群 体克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测： [0011]以正向引物PC M1237‑F 5'‑CGCACACT TCTTCACCCTCT‑3'， [0012]和反向引物PCM1237 ‑R 5'‑AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT ‑3'扩增目的片段， 利用 琼脂糖电泳检测目的片段 是否被扩增出； [0013]4)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并进行统计分析： 将扩增出的PC R产物用4％的聚说　明　书 1/6 页 3 CN 114959056 A 3